vSGLT

Le transporteur de Na+/galactose exprimé dans la bactérie Vibrio parahaemolyticus (vSGLT) fait partie de la famille des symporteurs de sodium/soluté (SSS, SLC5) dont les membres cotransportent des sucres, des acides aminés, des cations inorganiques et des vitamines (Wright et al., 2004; Wright and Turk, 2004). Il possède une identité de séquence de 32% (60% de similarité) avec son homologue humain, le cotransporteur de Na+/glucose SGLT1. En 2008, le laboratoire de Abramson a obtenu la structure cristallographique de vSGLT lié au galactose à une résolution de 2,7 Å dans une conformation orientée vers l’intérieur de la cellule (Faham et al., 2008). Des 543 résidus constituant vSGLT, 512 on été reconstruits. La structure présente 14 STM1 _{dont un cœur fonctionnel de 2 répétitions}

topologiques inversées de 5 hélices transmembranaires (STM 1 à 5 et STM 6 à 10) pouvant être superposées par une rotation d’environ 153° par rapport au plan de la membrane (Figure 1.10). Les hélices 1 et 6 sont brisées près du centre de la membrane au niveau des résidus Ile 65, Ser 66 et Ala 67 (STM 1) et Phe 266, Asn 267, Gln 268 et Tyr 269 (STM6). Les extrémités N et C terminales se trouvent dans le périplasme.

1 _{Dans les publications subséquentes à celle présentant la première structure de vSGLT, le système de}

numérotation des STM à été revu de façon à ce qu’il y ait une correspondance avec les STM de LeuT. Ainsi, les 14 STM de vSGLT sont maintenant numérotés comme suit : -1, 1, 2, …, 13. Nous utilisons d’emblée cette convention pour discuter de la première structure de vSGLT.

Figure 1.10 Structure occluse orientée vers l’intérieur de vSGLT en complexe avec un galactose et un ion Na+ _{(postulé). On a aussi représenté les deux répétitions inversées.}

Dans la structure de vSGLT, le galactose est situé au centre de la membrane et son anneau pyranose interagit avec le résidu aromatique Tyr 263 qui bloque l’accès au vestibule intracellulaire près de l’interruption dans le STM 6 (Figure 1.11). Cet acide aminé, en plus de Tyr 262 et Trp 264 forment la porte mince intracellulaire. De l’autre côté, les résidus hydrophobes Met 73, Tyr 87 et Phe 424 constituent la porte mince extracellulaire qui permettrait de retenir le galactose dans son site une fois le vestibule extracellulaire ouvert. Les acides aminés formant les portes minces de vSGLT jouent un rôle crucial dans l’occlusion du substrat car ils sont conservés dans la famille SLC5. La coordination des groupes hydroxyle du galactose est assurée par des ponts hydrogènes avec les chaînes latérales des résidus Gln 69, Glu 88, Ser 91, Asn 260, Lys 294 et Gln 428. La mutation de chacun de ces acides aminés en alanine résulte en l’abolition du transport de galactose dans des protéoliposomes, sauf pour S91A, ce qui démontre leur importance dans le mécanisme de transport.

Figure 1.11 Vue de l’extérieur de la membrane illustrant les portes extracellulaires (a) et le site de liaison du galactose (b) dans vSGLT (tirée de (Wright et al., 2011)).

La présence d’un ion Na+ _{dans vSGLT n’est pas démontrée hors de tout doute à}

cause de la résolution insuffisante de la structure et de l’impossibilité de cristalliser avec les ions Rb+ et Cs+. Cependant, en comparant vSGLT avec la structure de LeuT (Yamashita et al., 2005), on a pu proposer un site potentiel pour le Na+ (Figure 1.12) similaire au site Na2 de LeuT. Situé à environ 10 Å du site du galactose, près du STM 8 et de la portion brisée du STM 1, l’ion Na+ serait coordonné par les oxygènes carbonyle de Ala 62, Ile 65 (STM1) et Ala 361 (STM 8). De plus, l’oxygène hydroxyle de Ser 365 (STM 8) pourrait former un pont hydrogène avec le Na+. Ce résidu est conservé dans la famille SLC5 et est essentiel à la fonction de vSGLT, ce qui appuie l’idée que le site proposé est effectivement un site de liaison pour le Na+. Cependant, la distance supérieure entre l’ion Na+ modélisé et les résidus qui le coordonnent dans vSGLT (3,1-3,8 Å) comparé à LeuT (2,2-2,5 Å) et Mhp1 (2,1-2,7 Å) laisse envisager que le Na+ est instable ou absent du site proposé dans la structure cristallographique de vSGLT (Abramson and Wright, 2009). Ceci est soutenu par des simulations de DM effectuées par un autre groupe (Li and Tajkhorshid, 2009) qui démontrent que l’ion Na+ diffuse à l’extérieur de son site vers le vestibule intracellulaire après seulement quelques nanosecondes. Lors de sa diffusion, l’ion Na+ interagit avec le

résidu chargé Asp 189 (STM 5) situé à environ 5 Å du site de liaison Na2. Ce résidu est conservé dans la famille SLC5 et pourrait avoir la fonction d’attirer l’ion Na+ afin de faciliter la diffusion hors de son site. La différence structurelle entre le site Na2 de LeuT, dans lequel l’ion Na+ demeure stable pendant des dizaines de ns de DM (Celik et al., 2008), et le site observé dans vSGLT semble provenir de l’angle supérieur entre les STM 1 et 8 de vSGLT par rapport à ceux de LeuT.

Figure 1.12 Site de liaison du Na+ _{dans vSGLT.}

Présenté dans la conformation occluse orientée vers l’intérieur (gris) et dans la conformation ouverte vers l’intérieur sans ligands (couleurs). Le changement de conformation produit une inclinaison de ~13° dans la portion brisée du STM 1 qui nuit à la coordination de l’ion Na+ (tirée de (Watanabe et al., 2010)).

En 2010, le groupe d’Abramson décide lui aussi d’étudier la stabilité de l’ion Na+ (Watanabe et al., 2010). Ils observent que l’ion Na+ quitte son site après seulement 9 ns de DM, confirmant ainsi l’idée qu’il n’y est pas lié de façon stable. Suite à la libération du Na+, le résidu Asn 64, situé dans la portion brisée du STM 1, forme un pont hydrogène avec le groupe O2 hydroxyle du galactose ainsi qu’avec la chaîne latérale du résidu formant la porte mince intracellulaire, Tyr 263. En continuant la simulation de DM, les auteurs

constatent que les liens entre Asn 64, Tyr 263 et le galactose se brisent, ce qui permet à la chaîne latérale de Tyr 263 d’adopter une nouvelle conformation rotamère (entre 52 et 110 ns) qui engendre la libération du galactose (~110 ns) vers le vestibule intracellulaire puis le retour de Tyr 263 dans sa conformation originale. Par contre, des simulations récentes présentés par le groupe de Tajkhorshid (Li and Tajkhorshid, 2011) indiquent que le galactose quitterait plutôt son site de liaison en suivant d'abord un chemin parallèle au plan de la membrane plasmique, puis en contournant Tyr 263, résultant en un mécanisme de relâchement qui est indépendant de la rotation de la chaîne latérale de Tyr 263.

Afin d’approfondir la compréhension du couplage entre le site Na2 et le substrat, le groupe d’Abramson obtient la structure cristallographique ouverte vers l’intérieur sans ligands du mutant Lys 294 Ala de vSGLT à une résolution de 2,7 Å (Watanabe et al., 2010). L’architecture de cette nouvelle conformation est similaire à celle de la structure occluse (Figure 1.13). La comparaison des deux structures permet d’identifier le « hash

motif » composé des STM 3 et 4 ainsi que de leurs équivalents dans la répétition inversée,

les STM 8 et 9. Le « hash motif » des deux structures peut être superposé avec un RMSD de 0,9 Å. De plus, les STM 2, 6 et 7 forment le groupe échafaud (« sugar bundle ») qui peut être superposé avec un RMSD de 0,5 Å. Ces résultats appuient l’hypothèse que la transition entre les conformations occluse et ouverte s’effectue à l’aide d’un mouvement de type corps rigide du « hash motif » et du groupe échafaud qui s’éloignent de 3° chacun l’un par rapport à l’autre (Figure 1.13). Cet écartement augmente le volume du vestibule intracellulaire d’environ 1400 Å3, permettant à davantage de molécules d’eau d’atteindre le site du galactose afin de faciliter sa libération. Cependant, le mouvement du STM 1 est indépendant de ce mécanisme. En effet, dans la conformation ouverte la portion de l’hélice 1 située sous sa région brisée s’incline de 13° vers le corps de la structure et vient moduler les interactions de Asn 64. En absence de Na+ et de galactose, Asn 64 effectue des ponts hydrogène avec Tyr 263 et Glu 88. Dans la structure occluse, Glu 88 coordonnait deux groupes hydroxyle du galactose. La conformation ouverte vers l’intérieur est aussi stabilisée par le pont hydrogène entre Ser 365, qui coordonnait le Na+, et Glu 68 de la portion brisée du STM 1. Dans l’ensemble, ces données suggèrent que Asn 64, qui brise ses

liens avec Tyr 263 et le galactose suite à l’inclinaison de la portion inférieure du STM 1, joue un rôle clé dans le lien structurel qui contribue au couplage entre les sites de liaison du substrat et du Na+.

Figure 1.13 Structure ouverte vers l’intérieur de vSGLT et sa superposition avec la structure occluse (tirée de (Watanabe et al., 2010)).

a) Structure ouverte vers l’intérieur qui illustre le « hash motif » en bleu et le « sugar

bundle » en vert. b) Changement de conformation représenté par la superposition des cœurs

fonctionnels des deux structures (structure occluse en gris).