Mhp1

Le transporteur de benzyle hydantoïne Mhp1 est membre de la famille des symporteurs de cation/nucléobase 1 (NCS1). Il possède une faible identité de séquence de 15% avec LeuTAa et de 16% avec vSGLT. Mhp1 catalyse le transport de 5-benzyle

hydantoïne vers le cytoplasme de Microbacterium liquefaciens où des enzymes peuvent transformer la molécule en tryptophane ou en phénylalanine. Des travaux de cristallographie ont d’abord permis de déterminer des structures de Mhp1 dans une conformation ouverte vers l’extérieur sans substrat à une résolution de 2,85 Å, ainsi qu’une autre à 4 Å représentant un état occlus mais toujours orienté vers l’extérieur où le benzyle hydantoïne est lié au centre de la protéine (Weyand et al., 2008). Un an et demi plus tard, en 2010, une structure à 3,8 Å du transporteur ouvert vers l’intérieur est publiée et permet d’établir plus solidement les bases moléculaires du mécanisme d’accès alterné (Shimamura et al., 2010). Mhp1 possède 12 STM (Figure 1.5) comprenant deux répétitions formées des segments 1 à 5 et 6 à 10 dont la topologie est inversée et reliée par une rotation de 168° par rapport à un axe situé au centre de la membrane et qui est parallèle à cette dernière. Comme

dans LeuTAa, les hélices 1 et 6 sont brisées en leur centre. En fait, 249 des 460 carbones α

des 10 hélices du cœur fonctionnel de Mhp1 peuvent être superposés à ceux de LeuTAa

avec un RMSD de 2,4 Å.

Figure 1.5 Structures ouverte vers l’extérieur et ouverte vers l’intérieur de Mhp1 (tirée de (Shimamura et al., 2010)).

La structure ouverte vers l’intérieur est colorée en saumon pour le « bundle », en vert pâle pour le « hash motif » et en bleu pâle pour les STM 5 et 10. Dans la structure ouverte vers l’extérieur, le « bundle » est rouge, le « hash motif » est jaune et les STM 5 et 10 sont bleus.

Le site de liaison du substrat est situé dans l’espace entouré des STM 3 et 8 et des sections brisées des hélices 1 et 6 (Figure 1.6a). Le groupe hydantoïne du substrat forme une interaction π avec la chaîne latérale de Trp 117 (STM 3) et partage des ponts hydrogène avec Gln 121 (STM 3) et Asn 318 (STM 8). Trp 117 et Asn 318 sont conservés dans tous

les membres de la famille NCS1. Lorsque Mhp1 effectue le changement de conformation de l’état occlus vers l’état ouvert vers l’intérieur, Trp 117 s’incline légèrement vers le centre du site tandis que Asn 318 et Gln 121 s’en éloignent, ce qui compromet la capacité de liaison du site pour le substrat (Figure 1.6b). La portion benzyle du substrat, quant à elle, interagit avec Trp 220 (STM 6) et Gln 42 (STM 1). Une comparaison de séquences suggère que le pont hydrogène que Gln 42 forme avec le substrat est un déterminant important de la sélectivité dans la famille NCS1 (Pantazopoulou and Diallinas, 2007). Il est intéressant de noter que lors du passage de la conformation ouverte vers l’extérieur à la conformation occluse, le résidu Trp 220 se rapproche du site de liaison.

Figure 1.6 Comparaison des sites de liaison du substrat et de l’ion Na+ dans les structures occluse (a) et ouverte vers l’intérieur (b) de Mhp1 (tirée de (Shimamura et al., 2010)). a) Le Na+ et le benzyle hydantoïne sont représentés en magenta et en cyan, respectivement. b) On a placé le Na+ et le benzyle hydantoïne où on les trouve dans la conformation occluse.

On a identifié un site de liaison au Na+ dans la structure occluse de Mhp1 à proximité du bout (début de la section brisée) de l’hélice 1a et du STM 8 (Figure 1.6a). L’ion Na+ est coordonné par les oxygènes carbonyle de Ala 38 et Ile 41 (STM 1) ainsi que celui de Ala 309 (STM 8). Les chaînes latérales de Ser 312 et de Thr 313 (STM 8) contribuent aussi à la coordination, de même que le moment dipolaire du bout de l’hélice 1a qui y joue vraisemblablement un rôle. Le couplage entre les sites de liaison du Na+ et du substrat pourrait provenir des résidus Asn 318 (STM 8) et Gln 42 (STM 1). Dans la structure ouverte vers l’intérieur, le site pour le Na+ semble déformé par l’éloignement de 4,5 Å du STM 8 par rapport au STM 1. En effet, des simulations de DM démontrent que l’ion Na+ quitte son site et diffuse vers le vestibule aqueux après moins de 2 ns dans la conformation ouverte vers l’intérieur, contrairement à la conformation occluse où il demeure dans son site pour plus de 100 ns et à la conformation ouverte vers l’extérieur où on a observé l’ion Na+ se libérer de son site après 18 ns dans une des trois simulations de 100 ns effectuées. Ces résultats suggèrent que l’ion Na+ n’est lié de façon stable que dans les deux conformations orientées vers l’extérieur.

Grâce aux trois structures dont on dispose, il est possible de formuler une hypothèse plutôt précise sur les changements de conformation qui constituent le mécanisme de cotransport de Mhp1 (Figure 1.7). Lorsque le transporteur est dans l’état ouvert vers l’extérieur, l’occlusion de la voie de perméation extracellulaire semble être initiée par le mouvement du résidu Trp 220 situé dans le STM 6, qui se répercute ensuite au STM 10 qui lui est adjacent et qui vient obstruer le vestibule extracellulaire en se pliant. Ce changement de conformation s’apparente au mouvement d’une porte extracellulaire mince, car la portion intracellulaire des segments d’une épaisseur de 20 Å demeure complètement étanche pendant ce mouvement et ne forme pas de vestibule orienté vers l’intérieur. La création d’un tel vestibule et la fermeture totale du passage extracellulaire nécessite le changement de conformation important engendré lorsque les STM 3, 4, 8 et 9 (le « hash

motif ») bougent à la manière d’un corps rigide par rapport aux STM 1, 2, 6 et 7 (le

« bundle »). Il en résulte la fermeture totale de la cavité extracellulaire par les extrémités C- terminales des STM 3 et 9, cette dernière étant déjà partiellement obstruée par la fermeture

de la porte mince (STM 10). Suite à cette réorganisation, la nouvelle position des STM 4 et 8 crée le vestibule intracellulaire. De plus, l’hélice flexible 5 se déploie légèrement afin d’ouvrir davantage la voie de perméation cytoplasmique à la manière d’une porte mince, comme le fait le STM 10 du côté extracellulaire.

Figure 1.7 Schéma du mécanisme de cotransport postulé pour Mhp1 (tirée de (Shimamura et al., 2010)).