Les différentes voies de régulation.

3.1.1. La voie de l’adénylate cyclase-AMPc-PKA.

Une élévation du taux intracellulaire d’AMPc ou la présence d’un analogue de l’AMPc (8Br- AMPc) stimule la sécrétion d’hCG par les trophoblastes normaux en culture (Feinman et al., 1986) mais également par des lignées cellulaires de choriocarcinome (Sibley et al., 1991). Les effets de l’AMPc sur la production de l’hCG sont générés par une action au niveau transcriptionnel des gènes α et β, à la fois sur les taux d’ARNm synthétisés et sur la stabilité de ces mêmes ARNm (Jameson and Lindell, 1988). Par ailleurs, l’AMPc a également été décrit comme un activateur de la N-glycosylation de l’hCG (Konrad and Merz, 1994).

Les cinétiques d’induction des ARNm de la sous-unité α et β de l’hCG sous stimulation d’AMPc sont très différentes. Pour la sous-unité α, l’activation de la transcription est plus rapide (quelques heures) que celle de la sous-unité β (environ 16 h) (Albanese et al., 1991).

- Le promoteur de la sous-unité α (figure 20)

Au niveau du gène de la sous-unité α, l’activation de la transcription a bien été décrite et correspond à l’activation de la voie de l’AMPc, mise en évidence pour d’autres gènes. Il existe différents éléments régulateurs situés dans la région 5’ flanquante du promoteur de l’hCG α. On note la présence d’un site TSE (“trophoblast specific element”) liant le facteur de transcription AP-2α (Johnson et al., 1997), un site αACT (“α activating element”) contenant un site consensus de GATA et capable de fixer aussi bien GATA2 que GATA3 (Steger et al., 1994). Il existe aussi deux sites CRE (“cAMP-Responsive Element”) adjacents et en tandem, de 18 pb chacun et présent aux positions -146 pb et -111 pb. Ces sites lient les protéines CREB (“CRE Bindind Protein”) (Knofler et al., 2000). On retrouve un site JRE (“junctional regulatory element”) fixant le facteur homeobox Dlx3 (“distal-less 3”) (Roberson et al., 2001). Notons enfin la présence d’une boîte CAAT, liant le facteur αCBF (“CAAT binding factor”)

Les protéines liant ces sites agissent en synergie. Une étude de mutagenèse a permis de définir la contribution individuelle de chaque élément activateur du promoteur de la sous-unité α, suite à une induction de l’AMPc (Knofler et al., 2000).

L’inactivation des éléments αACT et JRE dans les cultures primaires de trophoblastes a montré que les facteurs (GATA et Dlx3) liant ces deux sites consensus contribuent à l’expression basale de la sous-unité α, mais pas réellement à l’expression induite au cours de la différenciation.

(“CRE Bindind Protein”), qui sous forme dimérisée va, par sa fixation aux séquences consensus CRE, induire la transcription du gène α de l’hCG (figure 21 et 22). La délétion des sites CRE réduit de manière drastique l’activation de la transcription de la sous-unité α lors de la différenciation des trophoblastes, suggérant que les facteurs de transcription CREB sont requis pour l’activation de la transcription de la sous-unité α lors de la différenciation des trophoblastes. De même, il semble que le facteur AP-2α est impliqué dans la transcription de la sous-unité α au moment de la différenciation, puisqu’une inactivation de la séquence TSE, induit une diminution de la transcription au moment de la différenciation des trophoblastes (Knofler et al., 2000).

Il est à noter que les protéines CREB ne sont pas les seules protéines phosphorylables par la PKA. En effet, des facteurs CREM (“CRE Modulators”), ATF-1 (“Activating Transcription Factor-1”), AP-1 (“Activator Protein-1”) et c-Jun interviennent également dans la modulation de la transcription du gène de la sous-unité α (Ryseck and Bravo, 1991) (Drust et al., 1991).

Les sites CRE peuvent également fixer les membres de la famille ATF. L’augmentation considérable de la phosphorylation de CREB-1 comparée à celle des ATF-1 suggère que CREB-1 est le facteur de transcription de la sous-unité α activé principalement par la voie de la PKA. ATF-1 phosphorylé pourrait donc augmenter ou atténuer les effets de CREB-1. En effet, ATF-1 peut avoir un effet antagoniste sur la transcription dépendante de CREB-1 par la formation d’hétérodimère (Knofler et al., 2000).

- Le promoteur de la sous-unité β (figure 23)

Les éléments régulateurs de la sous-unité β de l’hCG ont été particulièrement difficiles à identifier, notamment à cause de l’absence d’une boite TATA et d’autres séquences canoniques, mais également à cause de l’activité transcriptionnelle relativement faible de ce promoteur comparé à celui de la sous-unité α. Il a été montré que plusieurs régions du promoteur de la sous-unité β de l’hCG fonctionnent en “combinaison” pour maintenir une expression basale (Steger et al., 1993).

Knöfler et al. (Knofler et al., 2004) ont montré la présence de trois sites TSE et de deux sites Sp important pour l’induction du taux basal de l’expression de la sous-unité β. Ces sites sont composés de séquences courtes riches en GC. Sur les sites TSE se fixe AP-2α, alors que Sp1 se fixe aux sites Sp. Les sites TSE et Sp sont des sites adjacents, de ce fait, dû à l’encombrement stérique il est impossible qu’un facteur AP-2α puisse se fixer si un facteur Sp1 est déjà fixé et inversement. Lors de l’activation de la voie de l’AMPc, c’est AP-2α qui va être responsable de l’augmentation de la transcription de la sous-unité β de l’hCG.

Des facteurs ont été décrits comme inhibant l’expression de l’hCG-β, il s’agit de C-Jun et Oct3/4. Ces deux facteurs se fixent sur des régions proches des TSE empêchant alors l’AP-2α de fixer.

Le facteur Sp3 est capable de réprimer l’activation de Sp1 d’une manière dose dépendante sur le promoteur de la sous-unité β de l’hCG. En fonction du ratio Sp1/Sp3, il va y avoir compétition de Sp1 et Sp3 sur les sites Sp. Le taux d’expression des facteurs Sp1, Sp3 et AP-2α varient au cours de la différenciation du syncytiotrophoblaste et sont donc impliqués dans la modulation de la transcription de la sous-unité β de l’hCG dans les trophoblastes (Knofler et al., 2004).

Il a récemment été montré que d’autres facteurs sont aussi impliqués dans la régulation de la sous- unité β de l’hCG. Le facteur Ets2 appartient à la famille des facteurs de transcription se fixant à un domaine ETS. Les facteurs Ets2 possèdent une séquence bHTH (“helix turn helix”) d’environ 85 acides aminés hautement conservés, responsable de la liaison à l’ADN. Deux sites Ets2 ont été identifiés dans le promoteur de la sous-unité β de l’hCG, ces deux sites sont capable de fixer les facteurs Ets2. Les facteurs Ets2 sont activés par Ras et par des facteurs agissant via la voie de transduction du signal Ras/MAPK, voie qui est elle même activée par l’augmentation de l’AMPc (Ghosh et al., 2003).

3.1.2. La voie de la phopholipase C-DAG-Ca2+_-PKC.

L’implication de la voie phospholipase C-DAG (diacylglycerol)-Ca2+_{-PKC dans la modulation}

de la synthèse et/ou de la sécrétion de l’hCG a été mise en évidence dans des trophoblastes normaux (Iwashita et al., 1992) (shi and Zhuang, 1993) et des lignées cellulaires provenant de choriocarcinome (Ilekis and Benveniste, 1985) (Yamawaki and Toyoda, 1994), grâce à l’utilisation d’ester de phorbol, d’analogues du DAG et des inhibiteurs de la PKC. Une réponse retardée, suggérant une modulation de la synthèse plutôt que celle de la libération de l’hormone, est enregistrée, montrant une augmentation des taux d’ARNm des chaînes α et β de l’hCG. Dans certains types cellulaires, la PKC est capable de phosphoryler des protéines appartenant à la famille des AP-1/Jun et Fos, qui régulent la transcription de gènes spécifiques en se fixant sur des PRE (“Phorbol ester-Responsive Element”) (figure 20). Ce type de séquence a notamment été décrit dans les choriocarcinomes. De plus, des études ont montré que la PKC était capable de stimuler la production d’AMPc et donc que cette kinase pouvait intéragir indirectement via les CREB sur la transcription des gènes α et β.

Le Ca2+ _{est impliqué dans la stimulation de la sécrétion d’hCG. Par ailleurs, il a été démontré,}

grâce à l’utilisation d’inhibiteurs ou de bloquants, qu’une entrée de calcium à travers des canaux calciques de type L ou par l’échange Na+_/Ca2+ _{lors d’une dépolarisation stimule la sécrétion d’hCG}

par des explants placentaires (Pollioti et al., 1994) (Meuris et al., 1994). Une autre étude, effectuée sur des cellules de lignée BeWo, n’a pas mis en évidence d’augmentation de sécrétion d’hCG en présence d’un ionophore calcique (Yamawaki and Toyoda, 1994).

Dans certains cas, une synergie d’action entre la voie de l’AMPc-PKA et DAG-Ca2+_{-PKC a}

été mise en évidence, se produisant au niveau de la transcription pour le gène de la sous-unité α et au niveau post-transcriptionnel pour le gène de la sous-unité β (Andersen et al., 1988). Sur les BeWo, une intéraction entre les deux voies a été suggérée par la phosphorylation possible de protéines CREB par la PKC.