Vitamines non hydrosolubles

Malgré leur appartenance à la classe B, certaines vitamines ne sont pas totalement hydrosolubles. L’acide para!aminobenzoïque (PABA ; B10) se dissout dans de l’éthanol à 70 % alors que la riboflavine (B2) et la biotine (B8) se dissolvent dans de la soude à 0,1 M (O'Neil, 2013). L’acide folique (B9) adopte un comportement différent. En effet il était recommandé (manuel Merck index) une dissolution dans de l’acide chlorhydrique. Cependant, cette vitamine re!précipite après quelques heures. Nous avons pu établir que l’acide folique ne peut être dissout qu’avec de la soude à 1 M. La solution obtenue est stable. Enfin, la phylloquinone (K1) est une vitamine liposoluble. Elle se dissout mal dans de l’éthanol mais très bien dans de l’acétone.

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Les vitamines ne sont pas nécessaires au développement de E. coli ou B. subtilis. Elles peuvent cependant influencer de manière positive ou négative la croissance des micro! organismes. Ces deux bactéries ont été choisies pour tester les effets des vitamines sur la croissance. Une troisième bactérie, exigeante du point de vue des vitamines fut ajoutée, S.

epidermidis.

Les premiers milieux synthétiques (MSaé) étaient composés d’une liste minimale de vitamines à une concentration de 5 mg/L afin de ne fournir que les vitamines indispensables. Des études ont montré les effets des vitamines sur la croissance de B.vulgatus (Varel and Bryant, 1974),

C. albicans (Dumitru et al., 2004) P. acnes (Ferguson and Cummins, 1978), S. aureus (Mah et al., 1967) et S. epidermidis (Hussain et al., 1991). Les vitamines définies suite à l’étude

bibliographique ont été incorporées au milieu nommé MSaé I (pour cette partie) afin d’améliorer la croissance du panel. Afin de ne pas ajouter de vitamines non nécessaires, ce milieu synthétique ne contenait pas de pyridoxal ni de pyridoxamine car la plupart des bactéries peuvent convertir la pyridoxine en ces deux vitamines. Cependant, S. epidermidis ne semble pas synthétiser les enzymes nécessaires à ces conversions car cette bactérie ne se développait pas dans ce milieu. De ce fait, ces deux vitamines ont été ajoutées au milieu MSaé II. Le tableau 17 récapitule la composition des milieux.

137 Afin de justifier l’ajout de vitamines dans les milieux synthétiques, les milieux MSaé, MSaé I et II ont été comparés à un milieu synthétique ne contenant pas de vitamines ainsi qu’au milieu TSB. Les résultats sont représentés dans la figure 42 et montrent que E. coli se développe plus rapidement dans le milieu TSB et ne semble pas influencée par l’absence ou

Figure 42 : Croissance d’E. coli, B. subtilis et S. epidermidis par détection visuelle dans des milieux synthétiques contenant des compositions différentes en vitamines.

30 46 118 46 64 0 46 64 144 46 ₄₀ 0 46 ₄₀ 192 0 50 100 150 200 250

E.coli B.subtilis S.epidermidis

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TSB MSaé Ø vitamines MSaé MSaé I MSaé II

Tableau 17 : Composition en vitamines des milieux synthétiques MSaé, MSaé I et MSaé II. Les vitamines en bleu sont uniquement présentes dans le milieu MSaé et MSaé II. Les vitamines en vert ne sont présentes que dans les milieux MSaé I et MSaé II.

138 par les différentes compositions en vitamines des milieux synthétiques. B. subtilis se développe avec un léger retard dans le milieu sans vitamine ainsi que dans le milieu MSaé. Cependant, les vitamines présentes dans les milieux MSaé I et MSaé II améliorent sa croissance par rapport au milieu TSB. S. epidermidis quant à lui ne se développe pas dans le milieu ne contenant pas de vitamines ainsi que dans le milieu synthétique ne contenant pas de pyridoxal et de pyridoxamine (MSaé I). Le développement bactérien devient visible après 144h dans le milieu MSaé et 192h dans le milieu MSaé II. Cette différence peut s’expliquer par la concentration en vitamines (voir partie suivante). Cette expérience a mis en évidence l’importance des vitamines dans les milieux synthétiques. Elles ne sont pas nécessaires à toutes les bactéries mais peuvent améliorer leur croissance comme c’est le cas chez B. subtilis. A l’opposé, S.epidermidis requiert des vitamines pour se développer. Au vu des résultats, le milieu MSaé II a été retenu. Il nécessitait cependant des améliorations notamment au niveau de la concentration en vitamines.

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Comme il est assez difficile d’analyser la composition en vitamine du milieu TSB, les concentrations des milieux synthétiques vont être directement inspirées par la teneur en vitamines des peptones de caséine et de soja référencée dans le manuel de microbiologie Merck (voir Annexe 5) qui ont été quantifiées par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP). Le milieu TSB contient 17 g d’hydrolysat de caséine et 3 g de peptone de soja. De ce fait, il suffit de calculer la concentration de chaque vitamine à la fois dans les 17 g d’hydrolysat de caséine mais également dans les 3 g de peptone de soja et d’additionner les deux. Pour les vitamines non répertoriées dans le manuel, la moyenne des autres concentrations de vitamines (170 µg/L) a été utilisée. Le tableau 18 indique les concentrations en vitamines des milieux MSaé et MSaé II.

139 Comme le montre la composition du milieu MSaé II, les calculs effectués précédemment ont donné des concentrations en vitamines assez faibles par rapport à celles du milieu MSaé. De plus, les expériences de la figure 42 ont montré que le MSaé II avait de moins bonnes performances en termes de vitesse de croissance chez S. epidermidis par rapport au MSaé, milieu qui a une concentration beaucoup plus élevée en vitamines. Pour résoudre ce problème, une gamme de concentrations en vitamines a été réalisée sur le milieu MSaé II et a permis de montrer que multiplier par dix la concentration de chaque vitamine (MSaé III) offrait de meilleures performances (figure 43).

Le milieu MSaé III offre les meilleures performances des différents milieux synthétiques et doit contenir l’ensemble des vitamines nécessaires au panel. La formulation en vitamines du milieu MSaé III a donc été retenue pour la suite du développement des milieux synthétiques.

Quelques tests sur des vitamines supplémentaires ont été effectués en utilisant le tocophérol, le rétinol et le cholécalciférol connus pour leurs actions antioxydantes ou leur nécessaire présence chez les animaux. Ces vitamines n’ont pas eu d’influence sur la croissance des bactéries testées (données non montrées).

Tableau 18 : Concentrations en vitamines des milieux MSaé, MSaé II et MSaé III. Le signe ! signifie l’absence de la vitamine dans le milieu.

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La composition en vitamines pour les milieux synthétiques est décrite tableau 19:

Figure 43 : Croissance de E. coli, B. subtilis et S. epidermidis dans les trois milieux MSaé et TSB.

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E. coli B. subtilis S. epidermidis

Te m p s (h )

Détection visuelle de la croissance bactérienne

TSB MSaé MSaé II MSaé III

Tableau 19 : Composition en vitamines du milieu synthétique. Les solutions mère sont réalisées à des concentrations de 100 mg/10ml selon le solvant indiqué.

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Le choix des vitamines n’est pas chose facile car certaines sont vitales pour les micro! organismes alors que d’autres ne sont pas requises pour leur croissance mais peuvent avoir un effet bénéfique sur cette dernière. Cependant, trop de vitamines présentes dans le milieu perturbent la croissance des micro!organismes à développement lent. Il semble difficile d’enlever une vitamine de la composition actuelle, étant donné que les milieux synthétiques doivent permettre d’obtenir la croissance du plus grand nombre de micro!organismes. Cependant une étude plus approfondie de la concentration de chaque vitamine est encore nécessaire afin d’optimiser les performances des milieux. Il est également envisageable qu’une vitamine améliorant la croissance d’une espèce bactérienne soit absente. Il est possible de vérifier l’impact d’une vitamine sur une bactérie de manière rapide. Une méthode similaire à celle de l’antibiogramme peut être utilisée : si un milieu synthétique est réalisé de manière solide, des disques imbibés d’une solution, d’une vitamine à tester, à différentes concentrations, pourraient être déposés sur le milieu synthétique solide. Un nombre d’UFC défini permettant d’obtenir un tapis bactérien serait déposé sur le milieu gélosé. Si la vitamine apporte un bénéfice à la croissance bactérienne, le tapis bactérien sera plus important au niveau du disque contenant la meilleure concentration (gradient de concentration dans la gélose).

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