Comparaison de milieux avec acides aminés à un milieu contenant leurs précurseurs

contenant leurs précurseurs

Les précurseurs des voies de synthèse des acides aminés ont également été testés. En effet, si l’incorporation des précurseurs permet d’obtenir les mêmes performances que l’ajout de tous les acides aminés, la formulation des milieux serait simplifiée. Certains acides aminés et le pyruvate sont au départ des voies de synthèse des autres acides aminés (voirfigure 11). En effet, l’acide aspartique est le précurseur de l’asparagine, la thréonine, l’isoleucine, la méthionine et la lysine. L’acide glutamique, quant à lui, est le précurseur de la glutamine, de la proline et de l’arginine. La sérine est au départ des voies de synthèse de la glycine et de la cystéine. Enfin, le pyruvate est le précurseur de l’alanine, la lysine, l’isoleucine, la valine et la leucine. Seuls la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane n’ont pas de précurseurs. Différentes concentrations de ces précurseurs ont remplacé la concentration en acides aminés du MSaé. La composition en aa des milieux MSaé aa P1 et MS aa P2 est représentée dans le tableau 13.

128 Ces milieux ont été testés sur quatre bactéries. Les résultats présentés dans le tableau 14 indiquent que les performances du milieu MSaé semblent meilleures pour E. coli, P.

aeruginosa et B. subtilis. Ces bactéries se développent toutes dans les milieux MSaé aa UPLC

mais avec un léger retard pouvant être de plusieurs heures chez B. subtilis. Les précurseurs d’acides aminés induisent une croissance retardée d’une vingtaine d’heures chez

P. aeruginosa et ne permettent pas la croissance de B. subtilis au terme de 70 heures. M. extorquens ne se développe que dans le TSB après 145 heures. Ces résultats suggèrent que

le milieu MSaé contient la formulation en acides aminés offrant la meilleure performance. Cette composition ainsi que ces concentrations ont été retenues pour la suite des expériences.

Tableau 13: Composition en acides aminés de différents milieux synthétiques. Le milieu MSaé est le milieu synthétique avec la concentration en aa de référence. Les milieux MSaé aa UPLC1 et 2 ont la formulation des acides aminés du TSB déterminé par UPLC MS. Les Milieux MSaé aa P1 et P2 ne contiennent que les aa précurseurs et du pyruvate permettant la synthèse de tous les acides aminés.

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La formulation retenue en acides aminés est la suivante :

DL!Alanine : 500 mg/L ; L!Arginine : 5 g/L ; Glycine : 500 mg/L ; Histidine : 250 mg/L ; L!Hydroxy! proline : 200 mg/L ; L!Isoleucine : 500 mg/L ; L!Lysine : 500 mg/L ; L!Leucine : 500 mg/L ; DL! Méthionine : 350 mg/L ; L!Proline : 250 mg/L ; DL!Phénylalanine : 500 mg/L ; DL!Serine : 750 mg/L ; DL!Thréonine : 500 mg/L ; DL!Valine : 375 mg/L ; L!Acide aspartique : 500 mg/L ; L! Aspartique glutamique : 1 g/L ; L!Tryptophane : 50 mg/L ; L!Tyrosine : 250 mg/L ; L!Cystine : 400 mg/L.

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Afin de trouver la meilleure manière d’incorporer les acides aminés dans les milieux, l’ensemble des acides aminés ainsi que leurs précurseurs ont été testés à différentes concentrations. Un retard de croissance évident est apparu dans les milieux ne contenant que les précurseurs des acides aminés. Les acides aminés insolubles dans l’eau sont à présent dissout dans de l’acide chlorhydrique afin d’obtenir un milieu final limpide. Une autre possibilité d’incorporer des acides aminés dans le milieu serait l’ajout de peptides. En effet, les acides aminés présents dans les milieux complexes sont majoritairement retrouvés sous forme de peptides et ne sont pas à « l’état libre » comme ils pourraient l’être dans les milieux synthétiques. De ce fait, l’assimilation de ces acides aminés par les micro!organismes n’est pas la même. En effet, les peptides vont être incorporés par des transporteurs différents, générant un métabolisme bactérien pouvant être également différent. L’ajout de peptides dans les milieux synthétiques est une piste qui n’a pas été explorée mais qui mérite qu’on lui porte une attention particulière. La composition des peptides issus des peptones et des extraits de levure est probablement totalement aléatoire. Il est donc impossible de reproduire la composition de ces peptides. Cela laisse alors une multitude de possibilités dans le choix du nombre et de la nature des acides aminés composants les peptides à incorporer au milieu. Obtenir la composition optimale semble de ce fait utopique. Il serait cependant intéressant d’évaluer dans un premier temps les performances de l’ajout de di ou tripeptides dans le milieu. Un mélange de différentes tailles de peptides est également envisageable et refléterait mieux la composition des milieux complexes.

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V. Les bases azotées

La concentration en bases azotées, précurseurs des acides nucléiques, n’a pas été quantifiée lors des analyses des milieux complexes. De ce fait, la réalisation de tests croisés (variation de la concentration d’une ou plusieurs bases azoté à la fois) s’est révélée être la seule méthode permettant de formuler la composition pour ces molécules.

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Les premiers milieux synthétiques réalisés contenaient les cinq bases azotées à des concentrations de 10 mg/L. Aucune souche ne se développait dans ces milieux. Des tests sur chaque base ont été réalisés faisant varier les concentrations des bases azotées une par une, en fixant les autres à 10 mg/L. Il s’est avéré que seuls les milieux dépourvus de cytosine ou à 1 mg/L permettaient la croissance de E. coli et P. aeruginosa. Les concentrations de 5 et 10 mg/L ne permettent pas la culture suggérant que ces concentrations sont inhibitrices dans le milieu de culture synthétique. Les autres bases puriques ont également été évaluées et la xanthine a permis d’obtenir une meilleure croissance chez E. coli. Par la suite, la cytosine a été testée sur tous les micro!organismes à une concentration de 1 mg/L et n’a pas montré d’effet toxique. Cette concentration n’a pas été modifiée par la suite. La xanthine a également été retenue pour être ajoutée aux milieux synthétiques. Les concentrations des bases azotées sont restées fixées à 10 mg/L.

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Les bases azotées contiennent des hétérocycles aromatiques pouvant expliquer leur mauvaise dissolution dans l’eau exceptée la cytosine qui se dissout jusqu’à une concentration de l’ordre de 10 mg/ml. Comme pour les acides aminés, plusieurs dissolutions ont été réalisées (tableau 15) afin de trouver le meilleur compromis entre la concentration du solvant et la durée de chauffage à 60°C.

132 Les meilleurs résultats pour E. coli et C. sporogenes ont été obtenus avec les milieux utilisant la combinaison des solutions suivantes : U5 + T5 + X5 + A4 + G4 et U4 + T4 + X4 + A3 + G3, soit les solutions contenant les plus faibles doses d’acide ou de base. Les procédures de dissolutions de 100 mg pour chaque base ont été les suivantes :

! Adénine: 100 mg dans 200 µl d’ HCL 3N mélangés à 9,8 ml d’eau milliQ ! Guanine: 100 mg dans 4 ml d’ HCL 3N mélangés à 6 ml d’eau milliQ

! Uracile: 100 mg dans 200 µl de NaOH 1N mélangés à 9,8 ml d’eau milliQ ! Thymine: 100 mg dans 200 µl de NaOH 1N mélangés à 9,8 ml d’eau milliQ ! Xanthine: 100 mg dans 2 ml de NaOH 1N mélangés à 8 ml d’eau milliQ ! Cytosine: 100 mg dans 10 ml d’eau milliQ

Chaque solution mère est chauffée à 60°C avec agitation pendant environ 30 minutes.

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Au cours du développement des milieux, deux gammes de concentrations en bases azotées ont été réalisées. La première gamme comprend les concentrations situées entre 0 à 10 mg/L pour toutes les bases azotées. La croissance d’E. coli montre une forte sensibilité suivant les différentes concentrations des bases azotées utilisées comme le montre la figure 41. Une concentration en chaque base azotée de 5mg/L donne les meilleurs résultats de croissance chez E. coli.

La seconde gamme consiste à modifier la concentration d’une seule base azotée comme le montre le tableau 16. Cette gamme a été testée sur quatre bactéries E. coli, B. subtilis,

P. aeruginosa et S. epidermidis. Les résultats obtenus ne permettent pas de conclure

facilement sur les concentrations optimales à utiliser car chacune des bactéries montre un comportement différent. De plus, pour une bactérie donnée, la différence de performance entre les milieux était souvent minime (données non présentées). De ce fait, la concentration en bases azotées retenue a été fixée à 5mg/L pour toutes les bases azotées sauf la cytosine pour laquelle la concentration sera de 1mg/L.

Figure 41 : Croissance d’E. coli par détection visuelle dans le milieu MSaé suivant les concentrations des bases azotées.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 TSB MSaé Ø ba MSaé ba 1mg/L MSaé ba 2mg/L MSaé ba 5mg/L MSaé ba 10mg/L Te m p s (h )

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Concentration finale de chaque base azotée :

Adénine : 5 mg/L ; Guanine : 5 mg/L ; Uracile : 5 mg/L ; Thymine : 5 mg/L ; Xanthine : 5 mg/L ; Cytosine : 1 mg/L.

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Les résultats montrent qu’il a été difficile d’estimer précisément la quantité de bases azotées nécessaire. Dans les milieux complexes comprenant des extraits de levure, ces bases sont probablement présentes sous forme de fragment d’ADN ou d’ARN. Pour vérifier cette hypothèse, de l’ADN d’E.coli a été ajouté aux milieux synthétiques contenant ou non les bases azotées. Les résultats ont été décevants car il n’y a pas eu de croissance dans les milieux ne contenant que l’ADN. De plus, la croissance n’a pas été améliorée dans les milieux contenant déjà les bases azotées. Cependant, cette expérience mérite d’être refaite avec différentes concentrations d’ADN ainsi que de l’ARN afin de valider ces résultats.

Tableau 16 : Gamme de concentration permettant d’évaluer la concentration de chaque base azotée. Chaque colonne représente les concentrations en bases azotées en mg/L d’un milieu synthétique MSaé (A!M). Les concentrations les plus fortes sont surlignées en rouge et les plus faibles en jaune.

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