Les différentes techniques d’analyse de la croissance des micro!organismes

Différentes techniques ont été évaluées afin d’analyser au mieux la croissance des micro!organismes.

I. Mesure de densité optique

Deux lecteurs de plaques ont été mis à contribution afin de pouvoir comparer les résultats.

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Les bactéries sont inoculées dans 50ml de milieu de culture à une concentration permettant d’obtenir entre 35 et 40 UFC pour 300 µl. 300 µl sont déposés dans chaque puit de la microplaque (655090 – Greiner Bio One). Les courbes de croissance sont réalisées par lecture de DO à 600 nm toutes les heures à l’aide du spectrophotomètre Gemini « SpectraMax

Plus384 » (Molecular Device). Une incubation 22,5°C ± 2°C est sélectionnée pour toutes les bactéries excepté M. extorquens qui est incubée à 32,5°C ± 2°C. L’appareil lit automatiquement l’ensemble des puits de la microplaque toutes les heures après agitation de la microplaque. Un logiciel d’exploitation « SoftMax Pro » permet de traiter directement les données obtenues et génère les courbes de croissance. Les expériences sont réalisées au minimum en triplicata.

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Le protocole est identique à celui utilisé pour le lecteur de plaque Gemini. On notera que l’inoculation est réalisée de manière à obtenir entre 35 et 40 UFC pour 250 µl et que toutes les bactéries sont incubées à 22,5°C ± 2°C. Lecteur de plaque : Bioscreen C MBR ; microplaque :Honeycomb ref : 9502550 logiciel : EZExperiment.

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II. Cytométrie en flux

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Les milieux de culture liquide R2B et TSB (Millipore) dilués à 50% avec de l’eau stérile ont été inoculés avec une culture de M. extorquens ATTCC 43645 à une concentration finale de 100 UFC/ml de milieu puis incubés 5 jours à 20!25°C. 3 aliquots de 1.0 ml de chaque milieu inoculé ont été prélevés au temps 0 puis toutes les 24 heures pendant 5 jours.

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La viabilité des populations bactériennes a été vérifiée avec le kit LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (L7007, Invitrogen). Les solutions concentrées A (Syto 9, 1.67mM / Propidium iodide, 1.67 mM, 300 µl de solution DMSO) et B (Syto 9, 1.67mM / Propidium iodide, 18.3 mM, 300 µl de solution DMSO) sont stockées à !20°C et protégées de la lumière. Après décongélation à température ambiante, les solutions sont brièvement centrifugées avant ouverture. La solution de travail est composée d’un mélange de 30 µl de solution A et 30 µl de solution B. 3 µl de la solution de travail sont ajoutés à 1.0 ml de suspension bactérienne. Les bactéries et les fluorochromes sont incubés à température ambiante, protégés de la lumière pendant 15 minutes. 200 µl de chaque aliquot contenant la suspension bactérienne marquée sont déposés dans une microplaque de 96 puits (353910, BD Falcon).

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Les mesures de cytométrie en flux ont été effectuées avec le système « guava easyCyte 5HT HPL » (0500!4009, Merck Millipore) équipé d’un laser bleu 75 mW (488 nm). L’analyse graphique du forward scatter (FSC) et side scatter (SSC) (par l’utilisateur) a permis de faire la discrimination entre les particules inorganiques et les micro!organismes. L’excitation/émission des fluorochromes sont 480/500 nm pour Syto 9 (fluorescence verte) et 490/635 nm pour l’iodure de propidium (fluorescence rouge). Les fluorescences

98 correspondantes ont été analysées sur la population bactérienne pour déterminer la viabilité et la concentration des micro!organismes parmi les éléments concernés. Les données ont été évaluées en utilisant le logiciel guavaSoft (2.6, Merck Millipore).

III. PCR semi!quantitative

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Pour chaque temps défini de culture , 100 µl de la culture de Methylobacterium sp. sont ajoutés à 400µl de tampon de lyse de composition 1M solution Guanidine hydrochloride, 0.5% solution N!Lauryl Sarcosyl, 5mMTris et 0.5mM EDTA dans des tubes eppendorf de 1.5ml. Les tubes sont ensuite immédiatement placés dans un instrument de sonication (optimisé par le laboratoire de recherche et développement de Merck Millipore Molsheim) et soniqués pendant 4min à une puissance de 750W et une fréquence de 20 kHz.

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Après sonication, les acides nucléiques sont purifiés au moyen du kit MilliPrep basé sur des billes magnétiques (Merck!Millipore ref. MPRPMYC48) et de l’instrument KingFischer ML (ThermoScientific, ref.5400050) permettant la purification de 15 échantillons simultanément.

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La PCR en temps réel utilisée pour détecter l’ADN de Methylobacterium extorquens est basée sur la technologie SYBR Green I qui se fixe à l’ADN double brin de manière non spécifique. Un fragment de 144pb du gène de l’ARNr 16S de M.extorquens a été amplifié en utilisant la paire d’amorces M.ext_F (5’!AACACATGCAAGTCGAGCGG!3’) et M.ext_R (5’! CGGCAGTAAACCTTTCCCCA!3’) synthétisés par Eurogentec (Belgique).

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Le mélange réactionnel a été préparé comme suit : 15µl du mix QuantiTect 2X (Qiagen, ref. 204145), 0.5µM de chaque primer, 2.25µl d’eau nuclease!free et 10µl d’échantillon ou d’ADN contrôle.

La PCR en temps réel est réalisée sur le cycleur Realplex (Eppendorf, réf. 6300 000.507) dans des plaques de PCR temps réel Twintec (Eppendorf, ref. 0030 128.672) selon le cycle : 95°C 15 minutes puis 40 fois [95°C 15 secondes – 58°C 60 secondes] suivi par la réalisation d’une melting curve afin de vérifier la spécificité du produit amplifié. Chaque échantillon est dupliqué et chaque essai de PCR contient un contrôle positif et un contrôle négatif. Les valeurs de Ct (cycle threshold) sont déterminées en utilisant l’algorithme automatique de détermination du seuil.

C. Méthodes d’analyse des composants des milieux complexes

I. ICP!AES (Inductively!Coupled Plasma Atomic Emission

Spectroscopy)

L’ICP!AES (inductively!coupled plasma atomic emission spectroscopy, en français spectroscopie à émission atomique) est une méthode d’analyse permettant le dosage des éléments inorganiques présents dans un échantillon qui a été préalablement ionisé. En effet, après dissolution de l’échantillon par un acide, celui!ci est injecté par un nébuliseur sous forme d’aérosol dans un plasma d’argon. La chaleur du plasma (pouvant atteindre 7700°C) va totalement ioniser l’échantillon. Les atomes alors excités vont émettre des photons. La longueur d’onde du photon est caractéristique de chaque élément. Les émissions de photons sont alors mesurées par un capteur permettant de connaître la quantité précise de chaque élément. L’ICP!AES a été utilisée pour évaluer la concentration des oligo!éléments dans les milieux de culture. Il s’agit d’un système de chromatographie en phase liquide à haute pression couplé à la spectrométrie de masse. Les acides aminés présents dans les échantillons à analyser sont dérivés à l’aide d’un chromophore (6!aminoquinolyl!n!hydroxysuccinimidyl carbamate, AQC) afin d’être détectés grâce à leur absorbance aux UV. Le passage de l’échantillon dans l’UPLC va permettre la séparation des composants. Le système va analyser