Visualisation de la dynamique de la clathrine

Pour l’étude de l’EDC, une autre méthode utilisée pour déterminer le moment et le site précis de formation d’une vésicule est de regarder la dynamique du profil de fluorescence de la clathrine. En effet, plusieurs études utilisent l’étape de déshabillage de la clathrine comme référentiel temporel pour déterminer la cinétique de recrutement des autres molécules participant à la régulation de la formation d’une vésicule. Comme décrit précédemment dans le schéma canonique de l’EDC, le déshabillage du manteau de clathrine est lié à la formation d’une nouvelle vésicule. Ainsi la co-Figure 18 | Exemples d’expériences d’internalisation de la transferrine et d’anticorps.

(A) Evolution temporelle de l’internalisation de la Tfn dans des cellules HeLa : (ᴏ) cellules non transfectées, ()

cellules transfectées avec la dynamine sauvage ou (●) cellules transfectées avec des formes mutées de dynamine impactant son activité GTPase. Les cellules ont été incubées avec de la Tfn biotinylée pendant la période de temps indiquée avant d’être soumises à des décapages de surface par réduction du pont disulfure liant la Tfn à la biotine. (B) Images d’une cellule contrôle (haut) et d’une cellule où l’expression des isoformes 1 et 2 de la dynamine sont supprimées (DKO) (bas) incubées pendant 15 min avec de la Tfn couplée au fluorophore Alexa 594 (10 µg/ml). Dans les cellules contrôles, la Tfn-A594 se trouve principalement au niveau intracellulaire et dans les endosomes tandis que dans les cellules DKO pour la dynamine, la Tfn se retrouve à la surface plasmique. (C) Internalisation d’anticorps dirigés contre le récepteur β2-adrénergique en présence ou en absence de son antagoniste l’isoprotérénol.

expression de la clathrine et d’une protéine d’intérêt permet de déterminer à quel moment de l’étape de formation de la vésicule, cette protéine d’intérêt intervient. Des exemples du profil de recrutement transitoire de la clathrine sont illustrés dans la Figure 19.

En partant de l’hypothèse que la disparition de la clathrine est un bon indicateur de la formation d’une vésicule, tout traitement entrainant un rallongement de la durée de vie de ces structures de clathrine implique une inhibition de la formation de vésicules. Par exemple, la perturbation de l’activité GTPase de la dynamine ou encore la stimulation des GPCR entraînent un blocage ou un ralentissement de la dynamique de la formation vésiculaire (Figure 20).

Figure 19 | Profils de recrutment de protéines alignés au moment de la disparition de la clathrine.

(A) L’extinction de la fluorescence de la clathrine est précédée de quelques secondes par un saut du niveau de

fluorescence de la dynamine. (B) La moyenne des profils de fluorescence indique que la dynamine se concentre au niveau des PRC de façon transitoire avant la scission, puis disparait en quelques secondes suite à la disparition de la clathrine. (C) Profil de recrutement de la dynamine (vert/cyan) alignés en fonction des différentes cohortes de temps de fluorescence de la clathrine (rose/orange). (D) Profil de recrutement d’Arp3 (un nucléateur de l’actine) est similaire au profil de recrutement de la dynamine (B), suggérant que l’actine peut être nécessaire après le déshabillage du manteau de clathrine.

Même si dans la plupart des cas une augmentation du temps de vie de la clathrine peut être corrélée à une réduction de l’internalisation de cargo (mesurée par des essais d’internalisation), il est aussi important de noter que la clathrine n’est pas le seul acteur majeur intervenant lors de la formation de vésicules. En effet, l’observation seule de la dynamique des structures de clathrine pour la détermination des internalisations peut entraîner des biais de deux façons différentes. Premièrement, les structures de clathrine ayant un temps de vie réduit (en dessous de 10 s) sont souvent considérées comme « non productives » dû au fait que ce temps est bien trop court pour que toute la machinerie nécessaire pour l’invagination et la scission soit mise en place et puisse jouer son rôle (Ehrlich et al., 2004; Loerke et al., 2009). Bien que cette hypothèse puisse faire sens, l'observation de l'évolution de la clathrine seule ne suffit pas à la valider. En effet, l’exclusion de ces structures (ayant un temps de vie réduit) des analyses peut sous-estimer l’activité d’endocytose de la cellule. Deuxièmement, il est connu que les structures de clathrine présentant des temps de vie de longue durée peuvent murir sur plusieurs intervalles de temps jusqu’à la formation d’une vésicule, et ce avant même que le signal de clathrine ne disparaisse dû au déshabillage du manteau de clathrine. Des études menées par mon Figure 20 | Observation des temps de vie des structures de clathrine pour évaluer l’activité

d’endocytose et l’effet de son inhibition.

(A-C) Kymographes montrant les points de clathrine au cours du temps. Le temps de vie de la clathrine à la

membrane plasmique est grandement augmentée par (A) l’application de dynasore, un inhibiteur puissant de l’activité GTPase de la dynamine, (B) et l’application de pitstop2, une petite molécule qui se lie au domaine terminal de la clathrine. (D) Le temps de résidence des structures de clathrine à la membrane plasmique est aussi augmentée par l’agrégation des récepteurs μ-opioïdes (MOR) induite par des agonistes. Des mutations ponctuelles favorisant (R94,96K) ou empêchant (K94,96R) son ubiquitylation affectent aussi ce phénomène.

Source : Adaptées de (A) Macia et al., 2006 ; (B) Meinecke et al., 2013 ; (C) von Kleist and Haucke, 2012 ; (D) Henry et al., 2012

laboratoire sur des lignées cellulaires (Merrifield et al., 2005; Taylor et al., 2011) et sur des cellules primaires comme les neurones d’hippocampe (Rosendale et al., 2017) suggèrent la possibilité que ces plaques de clathrine de longue durée peuvent subir plusieurs cycles d’internalisation de cargo avant même que la clathrine marquée ne disparaisse. En conclusion, le postulat de la correspondance entre disparition de la clathrine et scission est contexte-dépendant et il se peut que la plupart de ces études sous-estiment la capacité de formation de vésicules.