Suivi de particules uniques

Une fois les reconnections entre les différentes détections effectuées, l’étude des différents comportements de diffusion des protéines est permise par le calcul du déplacement quadratique Figure 58 | Localisations de molécules individuelles.

(A) Image source des molécules individuelles détectées (encadré vert). (B) 1er plan d’ondelette. (C) 2ème plan d’ondelette. (D) Image segmentée : suppression du bruit et identification des molécules individuelles par création d’un masque spatial. (E) Localisation du centroïde sur l’image segmentée pour chaque molécule individuelle.

Source : Adaptée de Izeddin et al., 2012

Figure 59 | Principe de la reconstruction des trajectoires par suivi de molécule individuelle.

(A) Lors de l’acquisition, une série d’images est prise,

contenant un nombre restreint de molécules marquées (points rouges). Les films contiennent plusieurs milliers d’images. Dans l’étape de localisation, l’image de fluorescence à un moment donné est analysée pour récupérer les positions des molécules. Après avoir répété l’étape de localisation sur une série temporelle d’images, les positions moléculaires des images successives sont reliées (pointillés blancs), en se basant sur une distance de diffusion maximale autorisée, pour générer des trajectoires qui suivent le mouvement des molécules individuelles (B).

moyen (MSD pour Mean Square Displacement). Le MSD représente la surface explorée par une molécule au cours du temps (Δt), en deux dimensions. Il est possible d’estimer le MSD d’une molécule en calculant la moyenne de ses déplacements au carré en fonction du nombre de pas de temps. Le premier point du MSD est ainsi calculé à partir des déplacements associés à un pas de temps (Δt1 = 1.Δt = 20 ms, traits et points verts), le deuxième point est calculé à partir des déplacements ayant lieu pendant deux pas de temps (Δt2 = 2. Δt =40 ms, traits et points rouges) enfin, le troisième point considère les déplacements s’effectuant pendant trois pas de temps (Δt3 = 3. Δt =60 ms, trait et point bleu) et ainsi de suite pour les points suivants (Figure 61A, B). On remarquera que l’estimation du MSD est d’autant meilleure que le nombre de déplacements considérés est important. Pour cette analyse il est important d’utiliser des trajectoires relativement longues i.e. possédant un grand nombre de pas. En effet dans ce cas, la moyenne des déplacements au carré s’effectue en considérant un grand nombre de déplacements ce qui permet de réduire l’incertitude quant à l’estimation de la MSD. Les derniers points de la MSD (qui considèrent des pas de temps importants) ne considèrent qu’un faible nombre de déplacements de sorte que l’incertitude est importante. Ces derniers points de la MSD ne sont donc souvent pas considérés par les algorithmes (Saxton and Jacobson, 1997).

Trois types de mouvements peuvent être caractérisés : (1) les mouvements browniens, représentés par une courbe linéaire du MSD, (2) dirigés, représentés par une courbe parabolique du MSD et (3) confinés représentés par une courbe atteignant un plateau, qui dépend des propriétés géométriques de la région de confinement. Les molécules ayant un mouvement brownien diffusent librement, celles ayant un mouvement dirigé diffusent et se déplacent à vitesse constante dans une direction préférentielle et celles ayant un mouvement confiné diffusent dans un espace limité, de sorte que les déplacements sont contraints, ce qui se traduit par une courbe MSD atteignant un plateau (Figure 61C).

Pour chaque courbe MSD, le coefficient de diffusion (D) peut être calculé en ajustant les quatre premiers points du MSD à l’aide de l’équation linéaire MSD(Δt) = 4DΔt (Figure 61B, D). Ceci fournit un coefficient de diffusion unique par trajectoire. On fait donc l’hypothèse que le comportement de la molécule ne change pas, ce qui ne sera pas toujours le cas pour les trajectoires les plus longues (>500 ms). Cependant, celles-ci représentent une petite minorité des trajectoires en PALM (Figure 67). Ainsi, pour une cellule donnée (ou une condition donnée) grâce aux nombreuses trajectoires, on peut former l’histogramme des coefficients de diffusion. Celui-ci est souvent en échelle logarithmique car les coefficients de diffusion varient sur plusieurs ordres de grandeurs. Il est alors possible de distinguer (éventuellement) plusieurs régimes : diffusif versus immobile (Figure 61D).

Une protéine est considérée comme immobile si sa surface d’exploration, pendant l’intervalle de temps utilisé pour calculer le coefficient de diffusion, est inférieure à la résolution spatiale du système appelée précision de pointée (σ). La précision de pointé mesure l’imprécision de la localisation (à cause du caractère stochastique de l’émission et la détection des photons émis et du bruit qui biaise la localisation). De sorte que les détections associées à une molécule ne seront pas toujours au même endroit et forment ce qui pourrait s’apparenter à une trajectoire. A cette trajectoire peut être associé un coefficient de diffusion. Le Dthreshold peut être calculé à partir de l’équation du MSD :

Dthreshold = 𝜎²

4 × 4 × ∆𝑡

=

La précision de pointée (σ) pour chacun des systèmes a été obtenue par mesure de la diffusion de molécules de dyn1-mEos3.2 dans des cellules fixées. Pour les expériences de sptPALM sur NIH-3T3, la précision de pointée du système (Olympus IX71, une caméra) est de 62 nm (en moyenne) donc toutes les protéines ayant un D inférieur à 0.012 µm2.s-1 (log(D) = -1.92) sont considérées comme immobiles. Pour les expériences de sptPALM sur MEF, la précision de pointée du système (Olympus IX71, deux caméras) est de 42 nm (en moyenne) donc toutes les protéines ayant un D inférieur à 0.0055 µm2.s-1 (log(D) = -2.26) sont considérées comme immobiles.

Les données de sptPALM montrent deux comportements diffusifs distincts de la dyn1-mEos3.2 à la membrane plasmique, représentés par une courbe à deux pics, avec une diffusion lente (avant la ligne noire en pointillée) et une diffusion rapide (après la ligne noire en pointillée). Pour obtenir cette séparation biologique des deux comportements, un ajustement non linéaire représentant la somme de deux gaussiennes a été fait sur la distribution des coefficients de diffusion, et la valeur de croisement de ces deux gaussiennes a permis de déterminer la séparation biologique (ligne en pointillée noire, Figure 60) entre les molécules à diffusion lente et à diffusion rapide. Pour les expériences avec les NIH-3T3 cette valeur est de 0.06 µm2.s-1, soit log(D) = -1.22 ; et pour les expériences avec les MEF TKO Dynamine, cette valeur est de 0.028 µm2.s-1, soit log(D) = -1.55.

Les coefficients de diffusion instantanées (Dinst) aussi appelé coefficients de diffusion glissants, peuvent être calculés en considérant des sous trajectoires (de longueur inférieure) d’une trajectoire donnée de molécule individuelle. Ces sous trajectoires sont utilisées pour calculer les déplacements au carré moyen (MSD) qui sont ensuite ajustés pour extraire le coefficient de la sous trajectoire. Dans la mesure où la sous trajectoire est formée au voisinage d’un point, le coefficient de diffusion obtenu permet d’estimer les propriétés de diffusion de la molécule lorsqu’elle se trouvait au voisinage de ce point. Cette approche permet de calculer les coefficients de diffusion le long de trajectoire et sont donc appelés coefficients de diffusion instantanées. Le Dinst permet d’avoir une information sur la vitesse de diffusion à chaque instant de la molécule unique.

L’analyse de pas permet de calculer la distance de déplacement d’une molécule individuelle entre

deux détections indépendamment de la longueur de la trajectoire (Das et al., 2015). Cette analyse permet de prendre en compte l’ensemble des trajectoires détectées (sans tenir compte d’un minimum de pas par trajectoire) et donne une information sur la diffusion des molécules en fonction de leur localisation subcellulaire. Ainsi les molécules présentant des petits pas mettent en évidence un comportement diffusif ralenti. A l’inverse, les molécules présentant des pas plus grands mettent en évidence un comportement diffusif plus rapide. L’analyse de pas est intéressante pour l’étude des diffusions au niveau des puits recouverts de clathrine comme nous le verrons dans la partie résultats (Figure 61E, F).

En pratique, dans nos analyses, nous avons utilisé empiriquement des trajectoires d’un minimum de 12 points pour l’étude des MSD, de 8 points pour l’étude des coefficients de diffusion et l’ensemble des trajectoires d’au minimum 2 points pour l’analyse de pas.

Figure 60 | Représentation des gaussiennes permettant la séparation des deux comportements diffusifs des molécules de dynamine.

Figure 61 | Analyses de suivie de molécules individuelles.

(A) Trajectoire fictive de 23 points d’une molécule individuelle. Trait vert : pas de 1 entre les points de la

trajectoire ; trait rouge : pas de 2 ; trait bleu : pas de 3. (B) Courbe MSD. Le schéma de la trajectoire en (A) montre la distance parcourue entre 2 images (chaque localisation pour chaque image est représentée par un point noir). La moyenne de la distance au carré de chaque pas, au sein de la trajectoire et pour chaque intervalle de temps Δt, donne un point sur la courbe du MSD avec Δt1 de 20 ms en vert, Δt2 de 40 ms en rouge et Δt3 de 60 ms en bleu, ainsi de suite jusqu’à la fin de la trajectoire (sachant que 20 ms est l’intervalle de temps entre chaque acquisition). La courbe de MSD permet d’extraire le coefficient de diffusion (D) qui représente la diffusion globale de la trajectoire. Le coefficient de diffusion (D) est la pente des quatre premiers points de la courbe MSD (ligne pointillée verte). (C) Différents comportements de la courbe MSD. Les trajectoires des molécules individuelles peuvent être immobiles ou confinées (mouvement immobile), diffusives (mouvement brownien) ou dirigées (mouvement dirigé). (D) Histogramme du logarithme décimal des coefficients de diffusion pour une protéine ayant un comportement à la fois immobile et diffusif à la membrane (Dyn1-mEos3.2). (E) Schématisation de trajectoires de différentes longueurs. (F) L’analyse de pas permet de calculer la distance de déplacement d’une molécule individuelle entre deux détections indépendamment de la longueur de sa trajectoire et permet d’apporter une information sur sa diffusion au niveau de domaines subcellulaires, notamment au niveau des puits recouverts de clathrine (PRC) ou les pas sont plus courts qu’à l’extérieur des PRC.