pCK-GFP3
Le vecteur pCK-GFP3 (Menand et al., 1998) possède l’origine de réplication colE1 et le gène de la ß-lactamase qui confère la résistance à l’ampicilline. Il est utilisé pour l’expression transitoire de séquences d’adressage fusionnées à la eGFP ("enhanced Green Fluorescent Protein") dans les expériences de localisation subcellulaire. La séquence de l'eGFP porte des mutations (L64F et S65T) permettant une meilleure fluorescence de la protéine (Youvan et Michel-Beyerle, 1996). Le vecteur pCK-GFP3 possède le promoteur 35S, deux séquences "enhancer" identiques, et le terminateur 35S du CaMV (Cauliflower mosaic virus), encadrant la séquence de la eGFP et permettant sa surexpression dans les plantes. Le site de clonage
pour l'introduction d'une séquence d'intérêt se situe en phase, en η’ du gène de la eGFP.
pCKmRFP
Le vecteur pCKmRFP (Vermel et al., 2002) est utilisé pour identifier les mitochondries dans les expériences de localisation subcellulaire. Il contient le gène DsRed1 qui code pour la RFP ("Red Fluorescent Protein"), fusionné à la séquence d’adressage aux mitochondries de la protéine COXIV de la levure. Ce plasmide est co-transfecté avec le pCK-GFP3 afin de localiser les mitochondries grâce à la fluorescence de la RFP.
pUCAP35S
Le vecteur pUCAP35S (van Engelen et al., 1995) est un vecteur dérivé d’un pUC dans lequel les sites de restriction rares AscI et PacI ont été rajoutés aux extrémités de la cassette de clonage. Il est utilisé pour le clonage de séquences codant pour des protéines de fusion GFP qui seront ensuite transférées dans le vecteur binaire pBinPlus contenant ces deux mêmes sites de restriction. La cassette de clonage du vecteur pUCAP35S contient, comme pour le pCK-GFP3, le promoteur 35S, une séquence "enhancer" en deux exemplaires, le gène de la eGFP et le terminateur 35S du CaMV, ce qui permet une surexpression de la protéine de
92 fusion dans la plante, et une meilleure visualisation de la protéine de fusion GFP. Contrairement aux vecteurs binaires, pUCAP35S est de petite taille et se réplique en grand nombre de copies dans les bactéries grâce à son origine de réplication similaire à celle d’un pUC. L'on peut donc obtenir une grande quantité de plasmide pour le séquençage de la construction et l'excision de l'ensemble de la cassette d'expression en vue du transfert dans pBinPlus. Il porte le gène de résistance à l’ampicilline.
pBinPlus
Le vecteur pBinPlus (van Engelen et al., 1995), dérivé du pBin19 (Bevan, 1984) est utilisé pour l’agrotransformation d’Arabidopsis. Un gène de résistance à la kanamycine sous le contrôle d’un promoteur bactérien permet la sélection de colonies transformées. Ce plasmide contient les séquences frontières du T-DNA, LB ("Left Border") et RB ("Right Border") qui permettent le transfert de séquences dans le génome nucléaire de la plante. Entre les séquences LB et RB, l'on trouve également les deux sites de restriction AscI et PacI qui
sont eux-mêmes localisés au milieu du gène LacZ codant pour la ß-galactosidase. δ’insertion
d’une séquence d’intérêt entre ces deux sites de restriction coupe donc le gène δacZ et permet une sélection supplémentaire blanc/bleu des colonies positives lors du clonage. Un deuxième gène de résistance à la kanamycine sous contrôle du promoteur NOS (nopaline synthase) permet de sélectionner les plantes transformées.
pACYC184LacZ
Le vecteur pACYC184LacZ (Miller-Messmer et al., 2012) est utilisé pour les expériences de complémentation fonctionnelle dans les bactéries mutantes. Il a été construit au laboratoire à partir de pACYC184 (Chang et Cohen, 1978) auquel a été rajouté le gène
lacZ codant pour la β-galactosidase, à l’intérieur duquel se trouve une cassette de clonage
multi-sites, permettant ainsi une sélection blanc/bleu des colonies transformées. Ce plasmide contient l’origine de réplication p1ηA, il est donc répliqué en faible nombre de copies et permet une expression de protéine plus proche des conditions physiologiques des bactéries. Il possède un gène de résistance au chloramphénicol, et sa cassette de clonage est sous le contrôle d’un promoteur bactérien inductible à l’IPTG, permettant ainsi de déclencher au moment voulu l’expression de la construction insérée.
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pUC18
Le plasmide pUC18 (NEB) (Bevan, 1984) est habituellement utilisé pour les clonages de routine. Il contient une cassette de clonage multi-sites à l’intérieur du gène lacZ pour une sélection blanc/bleu, ainsi qu’un gène de résistance à l’ampicilline. Ce plasmide a été utilisé tel quel dans les expériences de complémentation bactérienne pour établir le rôle de RECG1 dans le contrôle de la réplication de molécules circulaires.
pBAD/Thio
Le vecteur pBAD/Thio (Invitrogen) contient le promoteur pBAD de l'operon bactérien
araBAD qui regroupe des gènes servant au transport et au métabolisme de l'arabinose
(Guzman et al., 1995). Il permet une expression de protéines hautement maitrisée dans E. coli et est habituellement utilisé pour l’expression de protéines toxiques ou pour en améliorer la solubilité. Ici, il a été utilisé comme le pUC18 comme témoin de la réplication dans les expériences de complémentation, et comme celui-ci il contient un gène de résistance à l’ampicilline.
pGEM-T easy
Pour le clonage direct de produits PCR, en particulier en vue du séquençage, le vecteur pGEM-T easy (Promega) a été utilisé. C’est un vecteur commercial qui est vendu linéarisé avec une thymidine sortante à chaque extrémité 3’. Cela permet l’insertion de produits de PCR que les Taq polymérases synthétisent avec des adénosines sortantes à chaque extrémité η’. Après amplification avec d'autres polymérases thermostables, qui ont généralement une activité de vérification ("proofreading") efficace, il est possible d’ajouter un A en η’ de chaque brin du fragment à insérer grâce à une post-incubation avec une Taq polymérase classique (Matériel et Méthodes 2.4.2.2.). Le vecteur pGEM-T easy est à haut nombre de copies. Il contient les promoteurs de la T7 et de la SP6 ARN polymérase flanquant
la cassette de clonage multi-sites au milieu du gène de la β-galactosidase, permettant une
sélection blanc/bleu des colonies transformées. Ce plasmide porte un gène de résistance à l’ampicilline.
pBluescript II SK+
Comme le pGEM-T, le pBluescript II SK+ permet une sélection blanc/bleu des
colonies et possède le gène de résistance à l’ampicilline. C’est dans ce vecteur que nous avons
Figure 45. Clonage par le système Gateway.
A. Réaction de recombinaison BP permettant l’entrée de l’insert dans un vecteur donneur
B. Réaction de recombinaison LR permettant l’entrée de l’insert dans un vecteur de
destination. A B gène ccdB ccdB gène
attB attB attP attP
attL attL attR attR Produit de PCR flanqué
des séquences attB
Vecteur donneur
BP Clonase II
Clone d’entrée Co-produit
gène ccdB
ccdB gène
attL attL attR attR
attB attB attP attP
Clone d’entrée Vecteur de destination
LR Clonase II
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pDONRZeo
Pour la plupart des clonages, les vecteurs de la technologie Gateway (Invitrogen) (Hartley et al., 2000) ont été utilisés. Cette méthode de clonage est basée sur le système de recombinaison du bactériophage lambda qui facilite son intégration à E. coli. Le système requiert d’une part, des séquences de recombinaison appelées "att" et d’autre part, un mélange de facteurs de recombinaison nommé "clonase". Cette technologie permet de générer un clone d’entrée possédant la séquence d’intérêt dans un vecteur donneur, et de transférer cette séquence dans n’importe quel vecteur de destination à l'aide d’une simple réaction de recombinaison (figure 45). Cela est utile par exemple pour exprimer une protéine dans différents systèmes et avec différentes étiquettes. D’une manière générale, les plasmides Gateway sont composés d’un gène de résistance à un antibiotique pour la sélection dans les bactéries, et d’une cassette de clonage composée des deux séquences attP (vecteur donneur) ou attR (vecteur de destination) flanquant un gène de résistance au chloramphénicol et le gène ccdB. La protéine associée au gène ccdB interfère avec l'ADN gyrase bactérienne (Bernard et
Couturier, 1992), et permet ainsi d’éliminer toute bactérie transformée avec un plasmide
n'ayant pas recombiné. Le pDONRZeo est un vecteur donneur qui possède un gène de résistance à la zéocine. Il possède les séquences attP et la recombinaison a lieu entre le fragment d’intérêt, flanqué des deux séquences attB, en présence du mélange d’enzymes BP clonase II (Invitrogen).
pMDC162
Le vecteur pMDC162 (Curtis et Grossniklaus, 2003) est un vecteur binaire de destination Gateway que nous avons utilisé pour les constructions associant un promoteur à étudier au gène de la ß-glucuronidase (GUS). Ici les séquences attR du vecteur se recombinent avec les séquences attL du plasmide donneur pDONRZeo recombinant en présence du mélange d’enzymes δR clonase, pour intégrer notre séquence d’intérêt, ici le promoteur putatif. Cette cassette de clonage par recombinaison est en η’ et en phase avec le gène GUS. Le plasmide confère une résistance à la kanamycine aux bactéries transformées. Les séquences frontières RB et LB du T-DζA permettant le transfert de l’information dans la plante via Agrobacterium tumefaciens, encadrent la cassette de clonage et le gène de résistance à l’hygromycine qui permettra la sélection des plantes transformées.
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pGWB40
Le vecteur pGWB40 (Nakagawa et al., 2007) a été utilisé pour la complémentation dans les plantes. Ce vecteur binaire de destination Gateway ne possède pas de promoteur en amont de la cassette de clonage, ce qui permet d’insérer le promoteur endogène correspondant au gène étudié. Il confère une résistance à la kanamycine aux bactéries transformées, et une résistance à l’hygromycine et à la kanamycine aux plantes transformées.
p0GWA
Le vecteur p0GWA (Busso et al., 2005) est un vecteur de destination Gateway qui a été utilisé pour la production de protéines recombinantes dans E. coli afin de générer des anticorps. Ce vecteur permet d’ajouter une étiquette composée de 6 histidines (6His-tag) à l’extrémité C-terminale de la protéine recombinante. Ici la cassette de clonage contenant les séquences attR est flanquée des séquences promotrices du phage T7, permettant la transcription de l’insert par la Tι ARζ polymérase. Ce promoteur est sous le contrôle de l’opéron lactose, inductible à l’IPTG. δe vecteur contient également un gène de résistance à l’ampicilline.