Les comparaisons et alignements de séquences, ainsi que les assemblages informatiques des constructions et les analyses de restriction, ont été réalisés à l’aide du logiciel εacVector (MacVector, Inc.). Pour la phylogénie, les alignements de séquences ont été réalisés avec
96 ClustalW. Pour modeler la structure de RECG1, un alignement a d’abord été réalisé avec la protéine RecG cristallisée de Thermotoga maritima grâce à ClustalX.
Les principaux sites utilisés pour les recherches dans les bases de données et alignements de séquences sont :
NCBI : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Base de données Arabidopsis : http://www.arabidopsis.org/
T-DNA express : http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress
δes logiciels de prédiction d’adressage aux organelles :
Predotar : https://urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html (Small et al., 2004)
TargetP : http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ (Emanuelsson et al., 2000)
SUBA3 : http://suba.plantenergy.uwa.edu.au/ (Tanz et al., 2013) Le logiciel pour créer les arbres phylogénétiques :
PhyMLv3 : http://www.phylogeny.fr/ (Dereeper et al., 2008)
Le logiciel de modélisation des protéines (manipulé par Marc Bergdoll) :
Modeler : https://salilab.org/modeller/ (Sali et Blundell, 1993)
Méthodes
2.
Bactéries
2.1.
2.1.1. Préparation de bactéries compétentes
2.1.1.1. Electro-compétentes
Deux mL d’une préculture de la souche adéquate d’E. coli (DHηα ou TOP10) ayant
poussé toute la nuit à 37°C sont utilisés pour inoculer 750 mL de milieu LB additionné de l’antibiotique correspondant au gène de résistance de la souche (acide nalidixique pour DHηα, streptomycine pour TOP10). δa culture est incubée à 3ι°C sous agitation jusqu’à une
A600=0,4, puis placée dans la glace pendant 20 min, et centrifugée à 2700 g pendant 10
minutes à ζ°C. Après deux lavages à l’eau froide stérile, le culot est lavé dans η0 mδ de glycérol 10% (v/v) froid. Après une centrifugation de 12 min à 3000 g, le culot est repris dans
97 répartie en aliquotes de η0 µδ qui sont congelées dans de l’azote liquide et conservées à -80°C.
Pour la préparation de cellules d’Agrobacterium électro-compétentes, la préculture pousse pendant 24 h à 28°C avec de la gentamycine à 15 µg/mL et de la rifampicine à 150 µg/mL. Soixante-dix µL de cette préculture sont utilisés pour inoculer 1 L de milieu LB avec
antibiotiques, et la culture est incubée à 2κ°C sous agitation jusqu’à atteindre une A600=0,4.
δe protocole est ensuite le même que pour la préparation d’E. coli compétentes.
Milieu LB : bacto-tryptone 1% (p/v) ; extrait de levure 0,5% (p/v) ; NaCl 0,5% (p/v), pH
ajusté à ι,0 (ajouter de l’agar 1% (p/v) pour obtenir du milieu LB solide).
2.1.1.2. Chimio-compétentes
Un mδ d’une préculture de la souche adéquate d’E. coli est utilisé pour inoculer 500 mL
de milieu LB additionné de l'antibiotique correspondant et de MgCl2 0,01 mM. La culture est
incubée à 1κ°C sous agitation pendant plus de 2ζ h, jusqu’à atteindre une A600≤0,ζ. δa culture
est stoppée par incubation 10 min dans de la glace puis les bactéries sont centrifugées à 2700
g pendant 10 minutes. Le culot est repris dans 80 mL de tampon TB puis incubé 10 min sur
glace. Les bactéries sont centrifugées une seconde fois 10 min à 2700 g, puis reprises dans du tampon TB. 1,ζ mδ de DεSO est ajouté avant d’ajuster le volume à 20 mδ avec le tampon TB. Les bactéries sont incubées 10 min sur glace puis elles sont réparties en aliquotes et conservées à -80°C.
Tampon TB : PIPES 10 mM ; CaCl2 15 mM ; KCl 250 mM ; ajuster le pH à 6,7 puis
ajouter MnCl2 55 mM et filtrer la solution.
2.1.2. Tests de complémentation de RECG1 dans E. coli
Pour les tests de complémentation, les souches JM103 sauvage et mutantes (ΔrecG et
ΔruvA) ont été utilisées. Le gène RECG1 synthétisé par Genecust a été transféré dans le plasmide pACYC184LacZ, entre les sites de restriction AscI et PacI. Cette construction a été
transfectée dans les mutants bactériens ΔrecG et ΔruvA, tandis que le vecteur vide a été
transfecté dans les deux mutants et dans la souche sauvage, en tant que contrôle.
2.1.2.1. Tests de sensibilité aux UV
Pour les tests de sensibilité aux UV, 25 µL de préculture de bactéries ont été inoculés dans 5 mL de milieu LB supplémenté avec du glucose 1% (p/v) et du chloramphénicol 10 µg/mL.
Souches bactériennes
Dose d'UV
(Joules/m2) WT ΔrecG RECG1 ΔrecG ΔruvA RECG1 ΔruvA
0 1E-04 1E-04 1E-04 1E-04 1E-04
5 1E-04 1E-04 1E-04 1E-03 1E-03
10 1E-03 1E-03 1E-03 1E-02 1E-02
20 1E-02 1E-02 1E-02 1E+00 1E+00
Figure 46. Dilutions des souches bactériennes utilisées lors de la complémentation, en fonction des doses d’UV appliquées.
98
d’IPTG et la culture a été incubée jusqu’à une A650=0,4. Différentes dilutions des suspensions
bactériennes ont été préparées, selon la dose d’UV appliquée, afin de faciliter le comptage des bactéries sur boite (figure 46). Cinquante µL de ces suspensions ont été étalés grâce à des billes de verre, sur boites de LB en triplicat, puis les boites ont été exposées à différentes doses d’UV-C (2ηζ nm) sous le contrôle d’un radiomètre. δes bactéries ont ensuite été incubées 20 h à 37°C au noir, pour éviter que les mécanismes de réparation UV-dépendants
ne se mettent en place. Le nombre de colonies sur chaque boite pour chaque dose d’UV a
ensuite été compté et comparé au contrôle sans UV.
2.1.2.2. Tests de réplication
Pour les tests de réplication pathologique de l'ADN génomique, les souches JM103
sauvage et ΔrecG ont été utilisées telles quelles. Pour les tests de réplication de plasmides
exogènes, les souches ont été transfectées avec le plasmide pBad/thio (Invitrogen) ou pUC18
(ζEB). δes cultures ont été incubées jusqu’à une A650=1,2, puis elles ont été diluées 400 fois
dans du milieu contenant du chloramphénicol à 10 µg/mδ ainsi que 0,2η mε d’IPTG pour induire l'expression de la protéine RECG1. δ’incubation sous agitation a été maintenue à
37°C, et des échantillons ont été prélevés dans la phase exponentielle à A650=0,4 et à A650=1,0.
Un échantillon de la phase stationnaire a été prélevé plusieurs heures après que la A650 soit
stable. δ’ADζ de ces différents échantillons a été extrait grâce au kit Gene Elute Bacteria (Sigma-Aldrich). Pour les tests sur la réplication du génome bactérien, une quantification relative des séquences OriC, TerA, TerB, YdcR et YdcS a été effectuée par qPCR. Pour les tests sur la réplication de plasmides exogènes, la quantification par qPCR a été effectuée sur le gène de résistance à l’ampicilline présent dans pBAD/Thio et pUC18.