Utilisation des souches de collection

III.5.2.1. Pré-culture des souches dans leurs milieux de culture et dans le milieu commun de croissance

Afin de s’assurer que les microorganismes sont bien dans leurs phases de croissance lorsqu’ils sont pulvérisés sur les mortiers ou lorsque les matériaux y sont immergés, les cultures sont d’abord repiquées dans 200 mL à 10% puis dans 2 L de milieu de culture à 10%, afin d’adapter les microorganismes à un volume plus grand. Les trois bactéries sulfo-oxydantes de l’étude (T. nivea, H. neopolitanus et A. thiooxidans) sont soient cultivées dans un milieu chacune (Tableau 11) ou soit dans un milieu commun de croissance (0,25 g.L-1 de CaCl2.2H2O, 1,4 g.L-1 de NH4Cl, 0,4 g.L-1 de MgCl2.6H2O, 5 g.L^-1 de Na2S2O3.5H2O et 50 g.L^-1 de NaCl). En effet, les bactéries peuvent être pulvérisées l’une après l’autre ou en même temps. Pour l’essai de pulvérisation des bactéries l’une après l’autre, Thriotrix nivea est repiquée une première fois deux semaines avant et une deuxième fois une semaine avant la pulvérisation. Halothiobacillus neopolitanus est repiquée une première fois 20 jours avant et une deuxième fois 10 jours avant la pulvérisation. Enfin, Acidothiobacillus thiooxidans est repiquée une première fois 6 jours avant et une deuxième fois 3 jours avant la pulvérisation. Pour les bactéries H.neopolitanus et A.thiooxidans, les milieux ont été modifiés en cours d’essai de pulvérisation. En effet, après deux mois de pulvérisation, les milieux de culture sont réalisés avec dix fois moins de phosphate par rapport au Tableau 11, afin d’éviter la formation de phosphate de calcium à la surface des mortiers, qui peut potentiellement engendrer une protection de la matrice cimentaire. Concernant le milieu commun de croissance, il ne contient pas de phosphate dès le lancement des essais (essai de pulvérisation des bactéries en même temps et essai d’immersion). Pour l’essai de pulvérisation des bactéries en même temps, elles sont repiquées dans ce milieu deux semaines avant la pulvérisation dans 200 mL à 10%, puis 1 semaine avant dans 2L à 10%. Pour l’essai d’immersion, les bactéries sont repiquées dans deux fois 200 mL, puis dans deux fois 2 litres, afin d’obtenir une solution bactérienne de 4 litres de bactéries en solution, permettant à tous les mortiers d’y être immergés.

Pour l’essai du biofilm artificiel, le repiquage des trois bactéries est réalisé qu’une fois. Le protocole précis est explicité dans la partie III.5.2.3. Pour cet essai, un biofilm à base d’agar et contenant les trois souches de collection sélectionnées, est déposé à la surface des mortiers. Afin de déterminer la quantité optimale d’agar permettant la gélification du milieu mais aussi la mobilité des bactéries, différentes solutions ont été préparées : une solution avec 1,5% d’agar, une avec 1% d’agar, une avec 0,5% d’agar et une solution avec 0,3% d’agar. La quantité d’agar optimale a été déterminée égale à 1%.

III.5.2.2. Méthode d’immersion en milieu liquide

Cet essai consiste à immerger 18 tranches de mortiers à base de ciment CEM I dans 4L de milieu bactérien, préalablement préparé (III.5.2.1), avec une concentration en H2S maintenue à 30 ppm (Figure 48). Les deux compartiments de l’essai sont reliés par un tuyau, de manière à produire de l’H2S qui bulle dans le milieu bactérien. Les échantillons sont suspendus dans un réacteur pour qu’ils soient complètement immergés dans le liquide. Une fois tous les 15 jours, la solution contenant les bactéries est remplacée par une nouvelle culture bactérienne. La mesure du pH du milieu bactérien est réalisée en continu grâce à un titrateur et un dénombrement sur gélose est réalisé avant et après chaque changement de milieu, afin d’estimer le taux de croissance de la suspension bactérienne . Lors du changement de la culture, le milieu est ajusté au pH précédemment atteint. Un prélèvement liquide est réalisé et est analysé en ICP, afin de déterminer les éléments relargués dans le milieu à différentes échéances (14, 28, 42, 56, 70, 84, 98, 112, 126, 140 et 154 jours). Cet essai est suivi pendant 4 mois.

Figure 48 : Schéma de l'essai d'immersion des échantillons de mortiers dans une culture liquide, avec de l'H2S apporté en continu.

III.5.2.3. Méthode de pulvérisation des bactéries l’une après l’autre (essais de pulvérisation 1 et 2)

Cette technique consiste à pulvériser les trois types de microorganismes présélectionnés sur des mortiers à base de ciment Portland (CEM I). Les échantillons (22 tranches de 2x2x0,2 cm) sont donc prétraités puis cet apport d’H2S est soit stoppé jusqu’à la fin de l’essai, soit maintenue à 30 ppm. Pour le premier essai, chaque type de microorganismes est pulvérisé sur les mortiers à l’aide d’une pompe (Figure 49), 4 secondes toutes les quatre heures pendant une semaine dans un ordre bien précis : T. nivea puis H. neopolitanus puis A. thiooxidans. Pour terminer le cycle, de l’eau distillée est

120 pulvérisée ensuite sur les échantillons pendant une semaine supplémentaire. La durée de chaque cycle est donc de 4 semaines et 5,5 cycles sont réalisés. L’expérience a donc une durée de 6 mois (prétraitement et pulvérisation).

Figure 49 : Schéma de l'essai de pulvérisation 1 des bactéries l’une après l’autre sur les mortiers à base de ciment CEM I avec arrêt de la source de soufre

Le deuxième essai réalisé est le même que le précédent, excepté le fait que la source d’H2S est maintenue à 30 ppm tout au long de l’essai (Figure 50). Afin de témoigner avec certitude de l’activité des bactéries, le pH de la culture est mesuré et un dénombrement sur gélose est réalisé avant et après chaque pulvérisation. Cet essai est suivi pendant 5 mois.

III.5.2.4. Méthode de pulvérisation des bactéries en même temps (essai de pulvérisation 3)

Cette méthode consiste à pulvériser les trois microorgani smes présélectionnés en même temps pendant 5 mois avec une concentration en H2S maintenue à 30 ppm tout au long de l’essai (Figure 50). La pulvérisation de 4 secondes toutes les 4 heures est ensuite lancée pendant deux semaines, puis le milieu est changé pour les deux semaines qui suivent. De la même manière que précédemment, le pH de la culture regroupant les trois souches dans un milieu commun est mesuré et un dénombrement sur gélose est réalisé avant et après chaque pulvérisation. Cet essai est suivi pendant 5 mois.

Figure 50 : Schéma des essais de pulvérisation 2 et 3 avec maintien de la source d’H2S en continu.

III.5.2.5. Méthode de dépôt d’un biofilm artificiel

Cet essai consiste à mettre en contact les microorganismes avec les mortiers à base de ciment CEM I sous forme de tranches (comme les essais précédents), par le dépôt d’un biofilm artificiel. La fabrication d’un biofilm artificiel a déjà été réalisée dans la littérature (Abrahamson et al., 1996; Coquet et al., 1998; Strathmann et al., 2000; Ghach et al., 2014) sur d’autres types de substrats. Les trois bactéries sulfo-oxydantes présélectionnées (Thriothrix nivea, Halothiobacillus neopolitanus et Acidothiobacillus thiooxidans) sont repiquées dans un milieu optimal de croissance, précédemment déterminé. Les trois bactéries étudiées sont repiquées à 10% les unes indépendamment des autres 1 semaine avant le lancement de l’essai. Lors du lancement de l’essai, les trois bactéries sont centrifugées et la suspension bactérienne est versée dans le milieu optimal de croissance des t rois bactéries simultanément. Un dénombrement sur gélose est réalisé, afin d’avoir le nombre de microorganismes présents dans le futur biofilm artificiel. La quantité d’agar optimale de 1%, précédemment déterminée, a été préalablement ajoutée dans le milie u commun de croissance. Les échantillons prétraités à l’H2S sont alors trempés quelques minutes dans le milieu gélosé pas encore solidifié, puis sont placés au réfrigérateur pendant 20 minutes. Après ces 20 minutes de solidification, les échantillons sont placés dans l’enceinte dont la concentration en H2S est fixée à 30 ppm (Figure 51). Le milieu de culture contenant les nutriments nécessaires à la croissance des microorganismes (le milieu commun de croissance dont la composition est précisée dans la partie III.5.2.1) est pulvérisé sur les mortiers régulièrement (7 secondes toutes les 4 heures). Cet essai est suivi pendant 5 mois.

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Figure 51 : Schéma de l'expérience de dépôt d'un biofilm artificiel sur des tranches de mortiers, avec de l'H2S apporté en continu.