Il est apparu ces dernières années que les miRNAs peuvent constituer des cibles thérapeutiques potentielles de plusieurs pathologies. Quatre études clés, trois réalisées chez la souris et une chez un primate (singe vert d’Afrique) ont amené la preuve du concept de thérapies ciblées contre les miRNAs (Elmen et al., 2008a; Elmen et al., 2008b; Esau et al., 2006; Krutzfeldt et al., 2005). Les quatre études se sont focalisées sur l’inhibition in vivo de miR-122. Ce miRNA, très abondant dans le foie, est impliqué dans l’homéostasie hépatique et dans le métabolisme du cholestérol. Une diminution ou séquestration de miR-122 in vivo diminue le cholestérol plasmatique, indiquant une application potentielle dans des cas d’hyper-cholestérolémies. De plus, miR-122 est capable d’augmenter la réplication du virus HCV (Hepatitis C Virus), suggérant que l’inhibition de ces fonctions pourrait servir à lutter contre ce virus (Jopling et al., 2008; Jopling et al., 2005).
L’inhibition de miR-122 est basée sur des oligonucléotides antisens qui après avoir été injectés dans la circulation sanguine ou en intra-péritonéal (dans une formulation saline) sont capables soit de le dégrader soit de le séquestrer in cellulo.
Les antagomiR sont constitués de bases ARN modifiées en 2’ par un groupement O-methyl (2’-O-methyl) ; les deux premiers ainsi que les quatre derniers ponts phosphate sont remplacés par des ponts phosphorothioate et un groupement cholestérol remplace le 3’-OH. Les groupements 2’-O-méthyl et les ponts phosphorothioate évitent la dégradation des molécules par les RNAses et permettent une meilleure interaction à leurs cibles. Le 3’- cholestéryl facilite le passage des molécules au travers des membranes cytoplasmiques et augmente ainsi leur entrée dans le cytoplasme. Les antagomiR entraînent alors une dégradation du miRNA ciblé mais les mécanismes ne sont pas encore connus (Krutzfeldt et al., 2005). Des modifications relativement similaires mais sans cholestérol en 3’ ont également été utilisées (Esau et al., 2006).
Les LNA-anti-miR sont constitués d’un mélange de bases ADN et LNA. Les LNA (Locked Nucleic Acid) sont des analogues de bases ARN bicycliques dans lesquels les riboses sont chimiquement bloqués par introduction d’un pont methylène reliant les atomes 2’-O et 4’-C
(Vester and Wengel, 2004). Tous les ponts phosphate sont remplacés par des ponts phosphorothioate, ce qui permet d’une part une augmentation de la stabilité de la molécule et d’autre part une meilleure pénétration dans les cellules des tissus périphériques (Crooke, 2000; Elmen et al., 2008b). Un autre avantage du LNA est qu’il augmente de façon drastique la spécificité d’interaction avec sa cible. De ce fait, des oligonucléotides modifiés de 16 bases suffisent à séquestrer miR-122 in vivo (Elmen et al., 2008a; Elmen et al., 2008b). La dégradation de miR-122 par un effet RNAse H dépendant n’est pas possible car tous les ponts phosphate ont été remplacés. En effet, la RNAse H dégrade l’ARN d’un duplexe ARN::ADN ou ARN::ADN/LNA que si l’ADN ou l’ADN/LNA contient au minimum 6 bases consécutives liées par des ponts phosphate.
Avec les différents inhibiteurs testés, la répression de miR-122 est effective jusqu’à 20-30 jours en utilisant un protocole de trois injections avec une périodicité de trois jours, indiquant des effets à long terme. La biodisponibilité d’un antagomiR-16 a été testée chez la souris (du fait de l’expression de miR-16 dans presque tous les tissus) et démontre que l’expression de miR-16 est diminuée dans tous les tissus testés mis à part le cerveau (Krutzfeldt et al., 2005).
Les expériences décrites ci-dessus utilisent des diminutions d’expression d’un miRNA
in vivo. Néanmoins, des gains de fonction de miRNAs sont possibles. En effet, dans un
modèle orthotopique de cancer pulmonaire chez la souris, il a été montré qu’une injection intra-nasale de let-7 est capable de réduire la formation tumorale (Esquela-Kerscher et al., 2008).
Dans certains cancers, il serait envisageable d’utiliser des anti-miRNAs par exemple contre les miR-372/373 qui sont considérés comme oncogènes, ou encore miR-21 surexprimé dans plusieurs cancers (He et al., 2005b; Lu et al., 2008; Voorhoeve et al., 2006). La réexpression de miRNAs fréquemment sous-exprimés dans plusieurs cancers tels que miR-1, -7, -101 ou encore -199b-5p considérés comme suppresseur de tumeur, serait possible (Esquela-Kerscher et al., 2008; Garzia et al., 2009; Morris and McManus, 2005; Nasser et al., 2008; Reddy et al., 2008; Sachdeva et al., 2009; Su et al., 2009). miR-221/222 pourraient également être utilisés dans des leucémies érythroïdes (Felli et al., 2005). Let-7 qui régule K- Ras et c-Myc, deux protéines fréquemment surexprimées dans les cancers, serait un bon candidat pour d’éventuelles thérapies anticancéreuses (Christensen et al., 2009; Johnson et al., 2005; Sampson et al., 2007). Ces miRNAs étant hautement conservés chez les primates, des
tests préliminaires chez le singe ou le chimpanzé pourraient mettre en évidence certains problèmes secondaires potentiels liés à la modulation des fonctions de ces miRNAs.
L’inhibition des miRNAs par des anti-miRNAs dans plusieurs tissus périphériques est possible du fait des modifications apportées aux oligonucléotides (3’-cholestéryl, ponts phosphorothioate, 2’-O-méthyl). Néanmoins, dans une optique de surexpression d’un miRNA, quelques inconvénients doivent être surmontés car peu de modifications sont possibles pour que le miRNA puisse être fonctionnel. Les miRNAs doivent :
- résister aux RNAses dans la circulation sanguine (Love et al., 2008). Pour les anti- miRNAs ce sont les différentes modifications apportées qui permettent une stabilité des molécules.
- pouvoir traverser les membranes cytoplasmiques pour atteindre le cytoplasme. Des ARN nus sont en général mal incorporés par les cellules du fait de leurs charges négatives.
- éviter d’être reconnus par le système immunitaire car certains ARN peuvent être immunogènes. Certaines modifications peuvent empêcher l’effet immuno-modulateur de petits ARN (Judge et al., 2006).
Plusieurs études (commentées par (Love et al., 2008)) ont développé différentes techniques, et notamment l’utilisation de vecteurs pour des siRNAs, afin de surmonter ces inconvénients. L’utilisation de ces vecteurs pourrait aider dans la surexpression des miRNAs in cellulo.
Les vecteurs viraux permettent de faire exprimer des miRNAs (ou siRNAs). Ces vecteurs permettent une expression constitutive des petits ARN sur du long terme. Néanmoins, ils peuvent être immunogènes, mutagènes, entraîner des effets toxiques lors de l’infection virale et la surexpression des miRNAs est a priori irréversible (Tomanin and Scarpa, 2004). De plus, les surexpressions de petits ARN à partir du noyau sont capables de saturer la machinerie d’export (exp5), influençant potentiellement l’expression des autres miRNAs (Grimm et al., 2006; Yi et al., 2005).
Les petits ARNs peuvent être encapsulés dans des particules synthétiques. Ce sont en général des liposomes ou des nanoparticules de polymères. Les liposomes, qui forment une bicouche lipidique autour des petits ARN, ont été utilisés pour délivrer des siRNAs in vivo (Li et al., 2008c; Palliser et al., 2006; Santel et al., 2006). Les SNALP (stable nucleic acid lipid particles) ont été utilisés pour délivrer des siRNAs chez le singe, et, aucune toxicité particulière n’a été observée (Zimmermann et al., 2006). Les nanoparticules de polymères, telles que la cyclodextrine ou encore le polyethylenimine (PEI) sont également utilisées pour
encapsuler des petits ARN (Bonnet et al., 2008; Hu-Lieskovan et al., 2005). Les liposomes ou polymères, qui sont polycationiques, se lient avec une haute affinité aux acides nucléiques (chargés négativement). Elles empêchent ainsi la dégradation des petits ARN dans la circulation sanguine sans induire de toxicité aigüe dans les organismes testés (souris, singe). De plus ces particules facilitent le passage des cargos au travers de la membrane cytoplasmique (Aigner, 2006).
Certaines études montrent qu’il est possible de cibler de façon plus ou moins spécifique certains tissus pour éviter que les particules ne soient métabolisées par le foie, ce qui permet des injections de drogues avec des doses moins élevées. En effet, l’ajout de ligands à la surface des nanoparticules tels que l’anisamide ou la transferrine, capables de se fixer à des récepteurs membranaires, augmente la spécificité de ciblage tumoral (Hu-Lieskovan et al., 2005; Li et al., 2008b; Li et al., 2008c).
Nos résultats expérimentaux suggèrent que miR-31 et -125b soient impliqués dans la progression métastatique des cancers mammaires. Pour les deux miRNAs, nos données sont contradictoires avec celles de la littérature ; il semble donc difficile de les utiliser dans des tests précliniques dans le modèle 4T1. Néanmoins, nous envisageons de continuer à exploiter le modèle 4T1 car plusieurs autres miRNAs sortis de nos cribles et dans la littérature constituent des candidats potentiels (figure 16). C’est le cas par exemple de miR-21 (Meng et al., 2007; Yan et al., 2008), -29a (Gebeshuber et al., 2009), -210 (Camps et al., 2008; Gee et al., 2008) qu’on retrouve surexprimés dans les tumeurs 4T1 par rapport aux 67NR. Pour miR- 21, -29a et -210, nous pourrions, suite à l’implantation des cellules 4T1 dans la glande mammaire de souris, injecter dans la circulation sanguine des LNA-anti-miR contre un de ces miRNAs. Il s’agirait alors d’observer si ces « drogues » sont capables de diminuer la colonisation métastatique pulmonaire des cellules 4T1 et/ou de réduire la tumeur primaire. mir-335 (Tavazoie et al., 2008) est sous-exprimé dans les tumeurs 4T1 par rapport aux 67NR. Il serait possible d’injecter dans la circulation sanguine une formulation contenant un duplexe de miR-335 sous forme vectorisée et apprécier une potentielle réduction des nodules métastatiques et/ou des tumeurs primaires.
En conclusion, toutes ces données suggèrent ainsi que la modulation des fonctions des miRNAs représente une possibilité thérapeutique contre les cancers. L’utilisation de siRNAs dans l’inhibition spécifique de gènes clés de diverses pathologies est également une voie prometteuse de thérapie. Plusieurs essais cliniques de phase (I, II ou III) qui utilisent des
siRNAs contre la dégénérescence maculaire (ciblage du VEGF), des virus (RSV : (virus respiratoire syncytial) ; HBV : (Hepatitis B Virus) ; HIV-1 (Human immunodeficiency virus type 1)), des tumeurs (primaires ou métastases) sont en cours (Love et al., 2008). De plus, beaucoup de phases précliniques contre diverses formes de cancer ont été réalisées. En particulier, dans des modèles murins immunocompétents ou immunotolérants, plusieurs évidences montrent qu’il est possible d’inhiber des tumeurs primaires mais aussi des nodules métastatiques (pulmonaires, osseux, hépatiques) avec des siRNAs ciblant des gènes clés de ces processus (Compagno et al., 2007; Delloye-Bourgeois et al., 2009; Hu-Lieskovan et al., 2005; Li et al., 2008a; Li et al., 2008b; Li et al., 2008c; Li and Huang, 2008; Takahashi et al., 2005; Takeshita et al., 2005).
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