L’introduction nous a permis de voir que l’expression des miRNAs est contrôlée au niveau transcriptionnel et au niveau de leurs maturations. Peu d’études relatent de mécanismes faisant intervenir le contrôle de la dégradation des formes immatures ou matures des miRNAs. Par exemple, lin-28 est capable de réguler de manière spécifique l’expression de let-7 par contrôle de la dégradation du pré-miRNA (Heo et al., 2008). Nous avons observé une répression globale de l’epxression des miRNAs lors d’un traitement œstrogénique des cellules MCF-7 et avons suggéré une répression transcriptionnelle précoce de l’expression des miRNAs, en particulier pour les pri-mir-21 et 181a~b-1. Cependant, nous pourrions envisager une activation de la dégradation des pri/pré-miRNAs par les exosomes nucléaires sous E2.
Les exosomes dont l’existence a été démontrée à l’origine chez la levure (Mitchell et al., 1997), sont des complexes macromoléculaires contenant des exoribonucléases 3’Æ5’ conservées au cours de l’évolution et qui participent au contrôle de la maturation, de la dégradation et de la stabilité de nombreux ARNs (pour revue (Houseley et al., 2006; Lykke- Andersen et al., 2009)). Ces complexes, également appelés chez l’homme PM-Scl (polymyositis-scleroderma syndrom), existent dans le cytoplasme pour réguler la stabilité des ARNm et dans le noyau pour réguler la maturation et la dégradation des snRNAs (small nuclear RNAs), snoRNAs (small nucleolar RNAs), des ARNr mais également des pré-ARNm (Allmang et al., 1999a; Allmang et al., 1999b; Anderson and Parker, 1998; Chen et al., 2001; Danin-Kreiselman et al., 2003; Houseley et al., 2006).
Six protéines (Mtr3, Rrp43, 41, 42, 45, 46) s’organisent en forme d’anneau ; cette structure est stabilisée par les protéines Csl4, Rrp4 et 40 pour former le cœur de l’exosome (Liu et al., 2006; Lykke-Andersen et al., 2009). A ce cœur protéique catalytiquement inactif vient s’associer de manière stable Rrp44 qui peut fonctionner en tant qu’exoribonucléase 3’Æ5’ et endoribonucléase, ou Rrp6 qui fonctionne en tant qu’exoribonucléase 3’Æ5’ (Lykke-
Andersen et al., 2009). Cependant, il est possible que certaines fonctions de l’exoribonucléase Rrp6 se fassent sans lien physique avec le cœur des exosomes, complexifiant la compréhension des mécanismes des exosomes (Callahan and Butler, 2008).
Plusieurs cofacteurs vont permettre le recrutement et l’activation des exosomes sur leurs ARN cibles (Houseley et al., 2006; LaCava et al., 2005; Lykke-Andersen et al., 2009). Au niveau nucléaire en particulier, les co-facteurs connus qui recrutent les exosomes de manière séquence-dépendante ou indépendante aux ARN cibles sont entre autre l’hétérodimère Nrd1/Nab3 (Vasiljeva and Buratowski, 2006), Rrp47 qui interagit avec Rrp6 (Mitchell et al., 2003), les complexes de polyadénylation TRAMP (Trf4p/Air2p/Mtr4p Polyadenylation complex) (LaCava et al., 2005), Mpp6 (Milligan et al., 2008) mais également des RNAses de type III (Danin-Kreiselman et al., 2003).
Récemment, la caractérisation à grande échelle des ARN régulés par les exosomes chez la plante (Arabidopsis thaliana) a mis en évidence que plusieurs pri-miRNAs sont la cible de ces complexes (Chekanova et al., 2007). Il existe ainsi une balance entre production de pré-miRNAs et dégradation des pri-miRNAs (figure 21). La maturation nucléaire des pri- miRNAs par le complexe DCL1-HYL1 libère les pré-miRNAs qui vont alors subir une série de maturation pour fournir des miRNAs matures. Pour certains pri-miRNAs, suite à l’action de DCL1-HYL1, le pré-miRNA ainsi que le brin situé en 5’ de la tige-boucle vont être oligoadénylés probablement par le complexe TRAMP, les entraînant alors vers la dégradation par les exosomes (Chekanova et al., 2007). De manière intéressante, le complexe TRAMP, impliqué dans la surveillance de la qualité des ARN, est intimement lié au processus de RNAi puisqu’il empêche une entrée d’ARN aberrants dans RISC (Buhler et al., 2008). TRAMP polyadényle l’extrémité 3’ des substrats d’ARN stables et entraîne leur dégradation 3’Æ5’ polyA-dépendante par les exosomes au travers de Rrp6 (LaCava et al., 2005).
Le fait que des RNAses III puissent recruter les exosomes et que ces derniers soient capables de réguler l’expression des pri-miRNAs chez les plantes nous permet d’envisager le mécanisme suivant dans les cellules MCF-7. Sous E2 et uniquement sur des gènes de miRNAs
contenant des promoteurs œstrogéno-régulés, le complexe de maturation des pri-miRNAs recruterait très rapidement les exosomes sur les pri/pré-miRNAs pour les dégrader. De plus, il a été suggéré que le recrutement des exosomes par des RNAse III pourrait contribuer à la régulation d’acides nucléiques considérés comme parasites (Danin-Kreiselman et al., 2003). Il est pensé que les miRNAs dérivent d’éléments transposables (Piriyapongsa and Jordan, 2007; Piriyapongsa and Jordan, 2008; Piriyapongsa et al., 2007; Shabalina and Koonin, 2008). Il est
donc concevable que sous E2 un signal soit envoyé pour dégrader très rapidement les pri/pré-
miRNAs car ils seraient reconnus comme des « parasites », et, qu’il faille ainsi limiter leurs expressions pour permettre la prolifération cellulaire.
Figure 21 AAAAAAAAAAA m7GpppN miRNA AAAAA A m7GpppN pré-miRNA pri-miRNA AAAAAA m7GpppN A A A A A A A A oligoadénylation de la tige-boucle et du brin situé en 5’ de la tige-boucle
dégradation par les exosomes
dégradation des pri-miRNAs production de miRNAs
exosome
Figure 21 : effet des exosomes dans la maturation des pri-miRNAs chez Arabidopsis
thaliana
Chez les plantes, les pri-miRNAs peuvent subir une série de maturations pour produire un pré-miRNA (rouge+vert) puis un miRNA mature (vert) (production de miRNAs). Certains pri-miRNAs, suite au clivage par le complexe DCL1-HYL1 (DiCer-Like 1- HYponastic Leaves 1), peuvent subir une oligoadénylation du pré- miRNA ainsi que du brin situé en 5’ de la tige-boucle (bleu) probablement par le complexe TRAMP (Trf4p/Air2p/Mtr4p Polyadenylation complex) (dégradation des pri-miRNAs). Ceci entraîne la dégradation des fragments oligoadénylés par les exosomes (rose). Cette figure s’inspire de (Chekanova et al., 2007).
Nous pourrions vérifier cette hypothèse en réalisant des protections aux RNAses sur une région de 200 nucléotides couvrant la tige-boucle d’un pri-miRNA œstrogéno-régulé à partir d’extraits d’ARN totaux provenant de cellules MCF-7 stimulées ou non par E2. Sur un
pré-miRNA, de la région 5’ et 3’ de l’ARN (par rapport à la tige-boucle) en fonction des conditions de traitement cellulaire. L’implication des exosomes dans la dégradation des pri- miRNAs sous E2 pourrait être vérifiée en réalisant des expériences d’extinction transitoire de
certaines composantes du complexe.