Utilisation des cendres de C.villosa pour l’élaboration de préparation à activité

4.3.1.1. Critères de sélection des souches fongiques

Les souches fongiques sont des champignons impliqués généralement dans les problèmes de la peau. Il s’agit de : Fusarium sp et Aspergillus sp. Ces souches d’origine clinique (pus et infections cutanées), ont été identifiées par le Laboratoire de recherche de Biochimie et de Microbiologie appliquée, université d’Annaba.

4.3.1.2. Milieux de culture

On utilise dans notre travail un milieu de culture spécifique nécessaire pour l’isolement, la purification des champignons et pour les tests antifongiques. C’est le milieu PDA (Potato dextrose agar). Les champignons sont conservés dans des tubes stériles contenant l’eau distillée stérile à 5°C.

4.3.1.3. Les agents antifongiques

Les cendres de C.villosa ont été incinérées préalablement pour servir à la préparation d’un mélange avec une matière grasse d’origine animale (beurre de bovins). La mixture a été faite avec des concentrations précises en tenant compte du taux d’humidité de la matière butyrique (la déshydratation), l’addition de sel (la salinité) et l’intervention des lactobacilles de la matière butyrique (la stérilisation du beurre). Ces préparations (Tableau 18) sont ainsi testées contre deux champignons (Fusarium sp et Aspergillus sp). La nystatine est utilisée comme un contrôle positif.

Matériel et méthodes

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Tableau (18) : Composition des mélanges testés à base de cendres et de matière butyrique

N° Symbole Mélanges testés

1 B Matière butyrique

2 Bs Matière butyrique stérile

3 Bd Matière butyrique anhydre

4 Bsd Matière butyrique stérile anhydre

5 Bn Matière butyrique additionnée du sel (NaCl)

6 Bsn Matière butyrique stérile et additionnée de sel

7 Bdn Matière butyrique anhydre et additionnée de sel

8 Bsdn Matière butyrique stérile, anhydre et additionnée de sel

9 C Cendres

10 B +C Cendres + Matière butyrique

11 Bs +C Cendres + Matière butyrique stérile

12 Bd +C Cendres + Matière butyrique anhydre

13 Bsd +C Cendres + Matière butyrique stérile et anhydre

14 Bn +C Cendres + Matière butyrique additionnée de sel

15 Bsn +C Cendres + Matière butyrique stérile et additionnée de sel

16 Bdn +C Cendres + Matière butyrique anhydre et additionnée de sel

17 Bsdn +C Cendres + Matière butyrique stérile, anhydre et additionnée de sel

4.3.1.4.Préparations des pré-cultures

Sur des boites de pétri, contenant le milieu PDA solide, on dépose un disque de chaque souche fongique au centre de chaque boite provenant d’une culture pure préparée au préalable. On les incube pendant 7 jours à température 28°C [148].

4.3.1.5. Antifongigramme (Méthode de contact direct)

 Principe

Pour l’évaluation de l’activité antifongique, on a adopté la méthode de contact direct où les diamètres de la zone de croissance du mycélium ont été mesurés dont le but est de calculer des taux d’inhibition [149].

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 Mode opératoire

- L’agent antifongique utilisé est le mélange (cendres/matière butyrique, w/v) qui a été testé avec des concentrations : 30, 40, 50, 60 et 70 (mg/ml).

- Ces concentrations sont obtenues par l’addition de 1ml des solutions préparées préalablement à 20 ml du milieu PDA tiède (encore à l’état liquide) dans un tube à essai. Après homogénéisation, le milieu est coulé dans des boites de Pétrie de 8,5cm de diamètre.

- L’inoculation se fait par le dépôt au centre de la boite d’un disque du mycélium d’environ 06mm de diamètre d’une pré-culture de 7 jours.

- Deux boites de Pétri contenant 20ml de milieu PDA, l’une est inoculée par la souche fongique pour servir de témoin négatif, l’autre avec un antifongique de référence qui est la nystatine (25 µg/ml de PDA) est aussi inoculée pour servir le témoin positif. Cette dose de nystatine représente la demi- concentration additionnée aux milieux sélectifs d’isolement des bactéries pour empêcher la croissance des champignons.

 Expression des résultats

- Après incubation à 28°C pendant 7 jours en tenant compte de la croissance de témoin négatif, on calcule l’indice antifongique (Pourcentage d’inhibition) qui est déterminé par la formule [149]: - Indice antifongique = (1-Da / Db) x100 avec :

Da : le diamètre de la zone de croissance de l’essai

Db : le diamètre de la zone de croissance du témoin.

A titre comparatif, des tests antibactériens ont été effectués pour chaque mélange préparé préalablement contre cinq souches de référence : Escherichia coli (ATCC 25922), Klebsiella

pneumonaie (ATCC 700603), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeroginosa

(ATCC 27853) et Enterococcus feacalis (ATCC 29212) en adoptant la méthode de puits [150]. - Principe : La méthode utilisée est celle de diffusion en puits sur gélose et elle que décrite par Berghe et Vlietinck (1991). Le milieu MH est coulé en boîte de pétri à une épaisseur de 8 mm. Après inoculation par inondation d'une dilution adéquate (DO≈0.1/ℷ = 625nm) de la souche à tester réalisée suivant une échelle de MacFarland, des puits de 6 mm de diamètre sont réalisés de manière concentrique dans la gélose MH en boite de pétri, puis un volume de 1ml de chaque mélange de concentration 50 mg/ml est introduite dans chaque puits [150].

Matériel et méthodes

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4.3.1.6.Détermination de valeurs critiques (CMI et CMF)

 Principe

Pour la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) et la concentration minimale fongicide (CMF), on a adopté la méthode de dilution en milieu solide qu’elle est décrite par Leite-De-Souza et al (2005) avec quelques modifications [151].

 Mode opératoire

Les mélanges préparés préalablement avec une gamme de concentrations de chaque mélange : 30, 40, 50, 60 et 70 (mg/ml) sont alors incorporées dans la gélose PDA en cours de solidification. À l’aide d’une anse de platine stérile, des disques de mycélium de culture jeune (après 7 jours d’incubation) de diamètre de 6mm ont été prélevés, ces derniers ont été déposés dans les milieux préparés préalablement avec des dilutions des agents à tester.

 Expression des résultats

La CMI a été déterminée en mesurant le diamètre de croissance des champignons pour évaluer la plus petite concentration pour laquelle aucun développement n’est visible à l’œil nu. Pour les boites qui ne présentent pas de croissance, le disque de mycélium est transféré sur un milieu PDA neuf pour déterminer la CMF de chaque mélange testé où il s’agit en parallèle d’évaluer la plus petite concentration pour laquelle aucun développement n’est visible à l’œil nu.