Activité antioxydante de l’extrait éthéré de G.alypum

Les extraits de la plante sélectionnée : Globularia alypum et de la plante (témoin) : Syzygium

aromaticum ont été testés pour leurs activités antioxydantes en adoptant quatre méthodes

d’évaluation.

4.2.1. Piégeage du radical libre DPPH

 Principe

Cette méthode est basée sur la réduction d'un radical libre très stable; le 2,2'-Diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH) en présence d'un antioxydant donneur d'électron [141].

Ce dernier est réduit à la forme d’hydrazine (non radical) en acceptant un atome d’hydrogène. La réduction du radical libre DPPH par un antioxydant peut être suivie par spectrophotométrie UV- visible, en mesurant la diminution de l’absorbance à 517nm provoquée par la présence de l’extrait. Le DPPH est initialement violet, il se décolore lorsque l’électron célibataire s’apparie. Cette décoloration est représentative de la capacité de l’extrait à piéger ces radicaux libres indépendamment de toutes activités enzymatiques. Ce test permet alors d’obtenir des informations sur le pouvoir anti-radicalaire direct de nos extraits.

 Mode opératoire

Le mélange réactionnel est préparé comme suit : 50 µl de différentes concentrations des extraits exprimées en mg/ml, dissous dans le méthanol sont ajoutées à 5 ml de la solution de DPPH (0,004% dans le méthanol) fraîchement préparée. Après une incubation de 30 minutes, à la température ambiante, l’absorbance à 517 nm est mesurée à des intervalles différents de temps jusqu’à l’obtention du plateau. La vitamine C, le BHT, l’acide gallique, l’acide citrique, l’EDTA et les extraits de S.aromaticum sont pris comme antioxydants de référence.

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 Expression des résultats

Le pourcentage d’inhibition du radical libre DPPH pour les différents extraits (I%) est calculé selon la formule suivante : I%= Ablanc-Aéchantillon/Ablanc x100

Ablanc : l’absorbance du contrôle réactif (ne contient pas l’extrait)

Aéchantillon : l’absorbance de l’extrait avec le réactif

Le pourcentage d’inhibition permet de calculer le paramètre EC50 «Efficient Concentration».

Ce paramètre a été introduit par Brand-Williams et ses collaborateurs et a été ensuite employé par plusieurs groupes de chercheurs pour présenter leurs résultats [142]. Il définit la concentration efficace du substrat qui cause la perte de 50% de l’activité de DPPH [143]. Ces EC50 sont

déterminées graphiquement par la droite de régression dont l’abscisse représente la concentration des échantillons et l’ordonné l’activité antioxydante en pourcentage. Le pouvoir anti-radicalaire relatif (APR) est inversement proportionnel à l’EC50 (APR = 1/EC50) [144].

4.2.2. La capacité antioxydante totale (Test Molybdate Phosphate)

 Principe

La capacité antioxydante totale (CAT) des extraits est évaluée par la méthode au phosphomolybdène de Prieto et al [145]. L’analyse de Molybdate Phosphate est un essai direct qu’on emploi principalement pour mesurer la possibilité et la puissance des antioxydants non enzymatique. Cette méthode dépend de la réduction du Molybdate (VI) au Molybdate (V) et la formation d’un complexe de Molybdate Phosphate de couleur verte, qui est détecté par spectrophotométrie en mesurant le changement de l'absorption à 695nm.

 Mode opératoire

Ce test nous a permis d’évaluer le statut antioxydant, en utilisant les antioxydants présents dans notre extrait comme réducteur dans une réaction redox colorimétrique, l’analyse de molybdate phosphate est réalisée en suivant le protocole décrit comme suit :

Un volume de 0.3 ml de chaque extrait méthanolique est mélangé avec 3 ml de solution du réactif (0.6 M acide sulfurique, 28 mM phosphate de sodium et 4 mM molybdate d’ammonium). Les tubes sont vissés et incubés à 95°C pendant 90 min. Après refroidissement, l’absorbance des solutions est mesurée à 695 nm contre le blanc qui contient 3 ml de la solution du réactif et 0.3 ml de méthanol et il est incubé dans les mêmes conditions que l’échantillon.

 Expression des résultats

La capacité antioxydante totale est exprimée en rapport de milligramme équivalents d’acide ascorbique par milligramme de l’extrait brut (mg EAA/ mg EB). Les expériences sont répétées 3

Matériel et méthodes

Page 63 fois. Les antioxydants la vitamine C, le BHT, l’acide gallique, l’acide citrique, l’EDTA et les extraits de S.aromaticum sont pris comme antioxydants de référence.

4.2.3. Réduction du fer (pouvoir réducteur)

 Principe

Cette méthode adoptée est celle de Yildirim et al avec quelques modifications [146]. Cette méthode dépend de la réduction du fer (III) qui est détecté par spectrophotométrie en mesurant le changement de l'absorption à 700nm.

 Mode opératoire

Les différentes concentrations des extraits dans le méthanol (1ml) sont mélangées avec 2.5 ml de la solution tampon phosphate (0.2 M, pH 6.6) et 2.5 ml de ferricyanure de potassium [K3Fe(CN)6]

(1%). Les mélanges sont incubés à 50°C pendant 20min. Après l’incubation, 2.5 ml d’acide trichloracétique (10%) est additionné. Le tout est centrifugé à 3000 tours pendant 10 min.

A la fin, 2.5 ml du surnageant de chaque concentration est mélangé avec 2.5 ml d’eau distillée et 0.5 ml de FeCl3, 6 H2O (0.1%). L’absorbance est mesurée à 700 nm. L’augmentation de

l’absorbance dans le milieu réactionnel indique l’augmentation de la réduction de fer. La concentration IC50 qui est définie comme la concentration des antioxydants nécessaire pour réduire

50% de la concentration initiale du thiocyanate ferrique est un indice utilisé pour comparer et exprimer la puissance des capacités réductrices des substances bioactives.

 Expression des résultats

Les résultats de la réduction de fer sont exprimés par l’augmentation proportionnelle de l’absorbance de chaque extrait testé qui indique l’augmentation de la réduction de fer. La vitamine C, le BHT, l’acide gallique, l’acide citrique, l’EDTA et les extraits de S.aromaticum sont utilisés comme contrôle positif.

4.2.4. Piégeage du radical H2O2

 Principe

Cette méthode adoptée est celle de Ruch et al [147]. Elle consiste à tester la capacité des extraits à piéger le radical libre H2O2.

 Mode opératoire

La solution de l’eau oxygénée (40 mM) est préparée dans une solution tampon phosphate (pH=7.4). Les différentes concentrations des extraits dissouts (1mg/ml) dans l’eau distillée (1ml) sont mélangées avec 0.6 ml de la solution de H2O2 (0.6 ml, 40mM). Les mélanges sont incubés à

Page 64 50°C. Après 10min, l’absorbance est alors mesurée à 230 nm pour un blanc de la solution de l’eau oxygénée sans solution tampon phosphate.

 Expression des résultats

Le pourcentage d’inhibition du radical libre H2O2 pour les différents extraits (I%) est calculé

selon la formule suivante : I%= Ablanc-Aéchantillon/Ablanc x100

Ablanc : l’absorbance du contrôle réactif (ne contient pas l’extrait)

Aéchantillon : l’absorbance de l’extrait avec le réactif

La vitamine C, le BHT, l’acide gallique, l’acide citrique, l’EDTA et les extraits de S.aromaticum sont utilisés comme contrôle positif.