Utilisation de cascades enzymatiques

2.6.1.3.1 Réduction du co-produit carbonylé

La plupart des tests d’activité basés sur le suivi de la formation du produit carbonylé avec une cascade enzymatique, font intervenir une déshydrogénase (DH) comme enzyme auxiliaire pour catalyser soit la réduction du carbonyle en alcool, soit son amination réductrice en présence d’ions ammonium. Dans les deux cas, l’activité peut être mesurée de façon continue par le suivi spectrophotométrique de la consommation du NAD(P)H à 340 nm (

ε

Schéma 52 : Détection en continu de l’activité enzymatique d’une TA à l’aide d’une déshydrogénase.

Le Tableau 9 regroupe les différentes DH qui ont été utilisées comme enzymes auxiliaires dans des tests d’activité pour les TA.

Tableau 9 : Déshydrogénases utilisées dans des tests d’activités de TA.

Enzymes Abréviation ^Donneur_d’amine ^Produit carbonylé

réduit

Réf.

AlcoolDH Lactate déshydrogénase LDH Ala Pyr ^196,201–₂₀₃

Malate déshydrogénase MDH Asp OA 188,204

Hydroxyisocaproate déshydrogénase HICDH Leu MOPA 205,206

Hydroxypyruvate-réductase HPA-Red Ser HPA 207

Hydroxyglutarate déshydrogénase HGDH Glu KG 208,209

AmineDH Glutamate déshydrogénase GluDH Glu KG 210–213

Alanine déshydrogénase AlaDH Ala Pyr 203

Leucine déshydrogénase LeuDH Leu MOPA 214

Pyrroline-5-carboxylate-réductase PYCR1 Orn ^Pyrroline- 5-carbo-xylate

202,207,215

Parmi les DH qui réduisent le co-produit carbonylé en alcool, on retrouve la LDH qui catalyse la réduction en lactate du Pyr formé à partir de L- ou D-Ala.196,201,203 Ce test est donc applicable pour une grande variété d’enzymes : des L- ou D-α-TA mais aussi des amine-TA qui, pour la plupart d’entre-elles, acceptent l’Ala comme donneur. Parmi les autres alcoolDH utilisées dans des tests d’activités de TA, on trouve la malate déshydrogénase (MDH) qui permet d’utiliser l’Asp comme donneur d’amine,188,204

l’hydroxyisocaproate déshydrogénase (HICDH) qui permet d’utiliser la Leu,205,206 ou encore l’hydroxypyruvate réductase (HPA-Red) qui permet de mesurer l’activité des SerTA.207 L’utilisation d’une hydroxycétoglutarate déshydrogénase (HGDH) qui catalyse la réduction du KG permet quant-à-elle d’utiliser le Glu comme donneur et de disposer ainsi d’un test au caractère générique pour les α-TA compte tenu du fait que le Glu est un substrat communément accepté par cette classe de TA.208,209

Parmi les amineDH, on trouve la GluDH210–213 qui permet, comme la HGDH, de disposer d’un test générique pour les L-α-TA en assurant la régénération du Glu utilisé comme donneur. L’emploi d’une AlaDH a aussi été rapporté pour régénérer l’Ala. Comme la LDH, cette dernière enzyme auxiliaire permet donc de disposer d’un test applicable à la fois pour des α-TA et des amine-TA.203 On peut aussi citer la LeuDH qui

régénère la leucine à partir du MOPA et qui a permis de mettre au point un test de criblage pour les BCAT.214 En plus du déplacement d’équilibre, les aminoacideDH (aaDH) permettent de régénérer le substrat donneur de la réaction et donc de maintenir sa concentration stationnaire, condition idéale pour la détermination de paramètres cinétiques. Cependant, la présence nécessaire d’ions ammonium à relativement forte concentration peut perturber l’activité de la TA étudiée. On peut enfin également citer l’utilisation d’une pyrroline-5-carboxylate réductase (PYCR1) qui catalyse la formation de proline à partir de la forme cyclisée du Glu-semialdéhyde et qui a permis de mettre au point un test d’activité pour les ornithine-TA.219

En complément des tests que nous venons d’évoquer, il est possible, afin de limiter les coûts ou bien de changer la nature du signal détecté, de procéder au recyclage du cofacteur de l’oxydoréductase. Une première méthode a été mise au point en utilisant la GDH qui régénère le NADH en oxydant le glucose en gluconolactone (Schéma 53).170,203

L’hydrolyse de cette dernière en acide gluconique, induit une acidification qui peut être aisément mise en évidence par pH-métrie, par dosage à l’aide d’une base permettant de stabiliser le pH ou encore avec un indicateur coloré comme le Phénol Red. Ce procédé a notamment déjà été utilisé pour le criblage d’amine-TA.170,203

Schéma 53 : Test pH-métrique utilisant une DH et la GDH. 2.6.1.3.2 Oxydation enzymatique du co-produit carbonylé

Certains tests sont basés sur la production de NAD(P)H par une réaction d’oxydation du produit carbonylé de la transamination. Ainsi la succinate-semialdéhyde déshydrogénase (SSDH) catalyse l’oxydation du succinate semialdéhyde produit à partir du GaBa. Ce test, est donc très utile pour l’étude des GaBaTA (Schéma 54).216–218

Schéma 54 : Test continu pour les GaBaTA utilisant la succinate-semialdéhydeDH (SSDH).

Ici aussi, la régénération du cofacteur sous sa forme oxydée a été appliquée dans différents tests pour changer la nature du signal et éventuellement permettre un déplacement d’équilibre. Le premier catalyseur qui a été utilisé pour ce type de régénération est la diaphorase. Elle permet de réduire différents composés chromogéniques parmi lesquels le premier fut le chlorure de 2-(p-iodophényl)-3-(p-nitrophényl)-5-phenyltétrazolium (INT) (Schéma 55) qui produit un composé absorbant à 500 nm.219 Par la suite, d’autres sels de tétrazolium, plus performants en termes de solubilité et de stabilité, ont été utilisés. On peut citer le 2-(2-méthoxy-4-nitrophényl)-3-(4-nitrophényl)-5-(2,4-disulfo-phényl)-2H-tetrazolium (WST-8), ou le disodium 2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxanilide (XTT) qui produisent tous deux des composés de type formazan, absorbant fortement vers 480 nm.217,220 La diaphorase a par ailleurs été remplacée par le 1-méthoxy-5-méthyl-phénaziniumméthylsulfate (1-méthoxy-PMS), en tant que médiateur rédox car il présente une plus grande stabilité en milieu tamponné. Il existe enfin une dernière variante qui associe la diaphorase avec la résazurine et qui conduit à la formation de résorufine, un composé fluorescent (λex = 530 nm, λem = 590 nm). Cette alternative permet d’augmenter de manière très importante la sensibilité du test en remplaçant la détection colorimétrique par une détection fluorimétrique.

Schéma 55 : Tests colorimétriques ou fluorimétriques mettant en jeu la régénération du NAD+.

Cette approche a été mise en œuvre dans différents tests comme par exemple un test trienzymatique adapté aux L-α-TA utilisant le Glu comme donneur primaire, une  -TA thermophile (OAT) permettant de régénérer le Glu en présence d’acide 5-aminopentanoique et d’une aldéhyde déshydrogénase (ALDH) oxydant le glutarate-semialdéhyde en acide glutarique en présence de NADP+, lui-même régénéré en présence de 1-méthoxy-PMS et de WST-8 (Schéma 56).217

Schéma 56 : Test pour les L-α-TA en jeu la régénération de NADP+ et la production de formazan. 2.6.1.3.3 Détection du co-produit carbonylé via d’autres réactions enzymatiques

Quelques tests n’utilisant pas des DH et le NAD(P)H comme vecteur du signal ont été décrits. C’est le cas du test à la citrate synthase (CS), qui a permis de mesurer l’activité de l’AspTA via la quantification de la production d’OA réalisée à l’aide de l’acétyl-CoA et du réactif d’Ellman (DTNB) permettant de quantifier le CoA-SH par colorimétrie (Schéma 57).221

Schéma 57 : Test pour l’ Asp-TA utilisant la citrate synthase (CS) et le DTNB.

On peut également citer un test mettant en jeu la pyruvate oxydase (PyrOx). Il repose sur la décarboxylation/phosphorylation du pyruvate en acétylphosphate en présence de phosphate inorganique et de dioxygène.222 Cette réaction produit du peroxyde d’hydrogène qui est facilement détecté en présence de 4-aminoantipyrine et de m-tolyldiéthanolamine qui conduisent à la formation d’un composé rose via une réaction d’oxydation catalysée par la peroxydase de raifort (horseradish-peroxydase : HRP) (Schéma 58).

Schéma 58 : Test colorimétrique pour les TA utilisant la PyrOx et l’HRP.

Ce test développé pour le dosage sanguin de l’Ala-TA présente l’avantage d’être basé sur l’emploi d’Ala comme donneur, ce qui le rend potentiellement applicable, à l’étude des amine-TA et des D-α-TA.