La classification selon Grishin

Peu de temps après celle de Mehta, et notamment grâce à l’élucidation de la structure d’une D-AlaTA93, d’une BCAT96 et d’une Ala-racémase, Grishin établit une seconde classification regroupant les TA et les EAPP qui est à la base de la classification communément utilisée aujourd’hui.71 Grishin définit tout d’abord des types de repliement (fold-types) pour l’ensemble des EAPP. Les familles α et γ sont ainsi regroupées dans le Fold-Type I (FT_I). La famille β correspond au FT_II. L’Ala-racémase est la seule représentante du FT_III97 et le Fold-Type IV, très différent des trois autres, est celui de la BCAT et de la D-AlaTA. L’AspTA, la Trp-synthase, l’Ala-racémase et la D -Ala-TA deviennent alors les représentants structuraux des FT_I-IV. Grishin définit aussi trois autres Fold-Types (FT_V-VII) comptant très peu de représentants. La Figure 9

donne une vision schématique de la structure protéique tridimensionnelle des 5 principaux FT.

Figure 9 : Présentation des FT_I-V des EAPP (respectivement (a)-(e)). Les triangles représentent les feuillets β et les ronds les hélices α. Le PLP, lié au résidu lysine est représenté en rouge.98

Suite à cette première classification, les TA font donc partie du FT_I, avec l’AspTA comme représentant, à l’exception de la D-Ala-TA et la BCTA qui appartiennent au FT_IV. Les enzymes du FT_I sont toutes actives sous la forme d’homodimères, même si certaines peuvent être composées de plus de sous-unités.87 Chaque monomère est constitué en moyenne de 450 résidus et est composé de 2 domaines. Un grand domaine (Figure 9a, éléments jaunes et violets) situé au milieu de la chaîne peptidique, est constitué par l’enchaînement de 7 feuillets β, et un second domaine (Figure 9a, éléments oranges et bleus) de plus petite taille contient quant à lui les extrémités C- et N-terminales.98 Le grand domaine est le lieu de fixation du PLP et le site actif est situé à l’interface formée par les deux grands domaines des deux monomères. Les TA du FT_IV sont, elles aussi, actives sous la forme d’homodimères, mais chaque monomère n’est plus constitué que d’environ 250 résidus. L’organisation des domaines change aussi puisqu’ici, les enzymes possèdent un grand domaine C-terminal qui contient le site de fixation du PLP et un petit domaine N-terminal (Figure 9d).98 Le nombre et l’agencement des éléments de structure secondaire composants les deux domaines sont en plus

radicalement différents de ceux du FT_I. Cependant, et de manière très intéressante, la

D-Ala-TA présente un site actif dont la structure est virtuellement l’image dans un miroir de celle des TA du FT_I, traduisant un phénomène d’évolution convergente.93 Dans le cas de la BCAT présentant le même FT que la D-Ala-TA, une inversion du mode de fixation du substrat explique la spécificité pour les L-aminoacides, comme dans le cas des TA de FT_I (Figure 10).

Figure 10 : Différents intermédiaires aldimines externes formés avec les TA de FT_I et IV.

En plus de les regrouper selon les FT_I et IV, Grishin propose une répartition des TA en 5 classes (C_I-5), qui seront complétées plus tard par 2 classes supplémentaires (C_VI et VII). La C_IV regroupe l’ensemble des enzymes du FT_IV, tandis que les TA de FT_I se répartissent dans les autres classes. Le Tableau 4, résume les différentes classifications des TA.

Tableau 4 : Résumé des classifications des TA selon Grishin, Mehta et selon la spécificité de substrat.

Classification selon Grishin Classificaiton selon Mehta Spécificité de substrats

Fold-Type Classe Famille Sous-Groupe Type

I ^I/II α I α-TA III II Amine-TA IV IV III α-TA I ^{V IV α-TA} VI/VII Aminosucre-TA

Au sein du FT_I, les classes I, II, III, et V diffèrent principalement par la structure et la disposition spatiale de leur extrémité N-terminale.98,99 L’extrémité N-terminale peut d’ailleurs, dans certains cas, être en contact avec le site actif et être directement à l’origine de la spécificité de substrat.100 Le site actif des TA de FT_I peut d’autre part être divisé en 2 parties. La première, très conservée, correspond au site de liaison du groupement phosphate (phosphate binding cup, Figure 11) composé d’aminoacides établissant des liaisons hydrogène avec le groupement phosphate. Ce site est retrouvé presque à l’identique, chez les enzymes de la Classe IV (FT_IV) et il est par ailleurs complété par un résidu Asp interagissant avec l’azote du noyau pyridine. 100

Figure 11 : Représentation générale du site actif des TA de Fold-Type I.

La seconde partie du site actif est en revanche très variable d’une classe à l’autre et au sein d’une même classe. Elle se situe à l’opposé de la partie conservée, par rapport au PLP, et définit le site de fixation des substrats (Figure 11, partie rouge). Cette poche contient aussi plusieurs résidus permettant une interaction spécifique avec le PLP. Parmi ceux-ci, un résidu aromatique situé sur la face ré du PLP assure une intraction de type « π-stacking ». Des résidus assurent aussi une interaction avec l’oxyanion du PLP. Un certain nombre de résidus variables interagissent avec les substrats et permettent notamment via des modifications de conformation d’assurer la liaison de différents types de substrat (dual substrate recognition). Cette « reconnaissance duale », qui est au cœur de la diversité des réactions de transamination, repose sur la présence de résidus flexible au sein du site actif lui-même globalement plastique. Ainsi, un résidu Arg est fréquemment impliqué dans la liaison de substrats présentant un groupement

carboxylique et son groupement guanidinium s’écarte lorsqu’un autre substrat non carboxylé est lié dans le site actif. La Figure 12 illustre ce phénomène dans le cas de la GaBaTA qui stabilise dans son actif à la fois le Glu et le GaBa.100 Le même type de phénomène est par ailleurs observé pour la plupart des TA qui acceptent à la fois le Glu et des acides aminés hydrophobes.

Figure 12 : Rôle d’un résidu Arg dans liaison du GaBa et du Glu par la GaBaTA.100

Cette structure générale du site actif se retrouve aussi chez les TA de FT_IV, pour lesquelles la « reconnaissance duale » joue aussi un rôle essentiel. Les quatre grands types de sites actifs que l’on retrouve chez les TA au sein des Classes I-V sont présentés dans la Figure 13.

Si chaque TA a sa propre spécificité de substrat, on retrouve cependant des tendances au sein d’une même classe. Ainsi, la C_I contient des α-TA actives avec les aminoacides canoniques (Ala, Tyr, Asp, Gln, etc.). La C_II, très proche de la C_I et souvent associée à celle-ci, comprend des TA actives avec des aminoacides de type hydrophobe et aromatique. La C_II comprend aussi des enzymes de type amine-TA catalysant le transfert d’amines dépourvues d’acide carboxylique en position α comme l’histidinol-phosphate.

C’est cependant la C_III qui regroupe la plupart des amine-TA (Tableau 5). Elle comprend ainsi aussi bien les β-TA, que les ω-TA ou encore les amine-TA proprement dites.

La Classe V regroupe des α-TA dont les substrats principaux sont Gly, Ala, Ser, ou encore la Phospho-sérine.

Figure 13 : Structures de site actif des TA. (A) Classes 1,2 et 5 (B) Classe III. (C) Classe IV, BCAT (D) Classe IV, D-TA.101

La C_IV (FT_IV) comprend, comme nous l’avons déjà évoqué, des D-α-TA à large spectre, des BCAT actives avec les L-aminoacides branchés hydrophobes mais aussi des

(R)-amine-TA récemment découvertes.102 Ces dernières catalysent des transaminations

mettant en jeu des amines chirales avec une stéréosélectivité complémentaire à celle des TA de C_III. Au vu de l’hétérogénéité des TA de la C_IV, il est probable que cette classe soit, dans un futur proche, divisée en plusieurs sous-classes. Enfin, les deux nouvelles classes décrites depuis peu (C_VI et VII), correspondent à des TA acceptant des substrats plus complexes et intervenant notamment dans la synthèse de composés de type aminosucre. Bien qu’encore peu étudiées, ces TA présentent un intérêt certain en biocatalyse.101

L’établissement de relations fiables entre la nature des résidus du site actif et le spectre de substrat constitue aujourd’hui un enjeu majeur dans le domaine de la biocatalyse.7 Compte tenu de l’évolution des méthodes bioinformatiques, de nombreux progrès devraient être faits dans ce domaine dans un futur proche.

Pour conclure ce chapitre, le Tableau 5 résume la classification des principales TA décrites à ce jour, classification que nous avons utilisée dans notre travail et dans ce manuscrit.100

Tableau 5 : Classification des principales activités TA répertoriées à ce jour.

Fold-Type Classe Sous-Type TA donneur + accepteur ^{Réaction type :} Type

I I/II L-α-TA AlaTA Ala + KG α-TA AspTA Asp + KG AroTA Aro + KG PreTA Préphénate + KG AadTA Aminoadipate + KG DapTA Diaminopimélate + KG KynTA Kynurénine + KG TyrTA Tyr+ KG

HisPTA Histidinol-phosphate + KG Amine-TA

III

β-TA

β-TA β-aminoacides + Pyr

Amine-TA

β-AlaTA β-Ala + Pyr β-PheTA β-Phe + Pyr TaurTA Taurine + Pyr

ω-TA

ω-TA ω-aminoacides + Pyr AcOrnTA Acétylornithine + KG Ala:GlyoxTA Ala + Glyox DaBaTA Diaminobutyrate + KG DaPaTA ^{Diaminopélargonate + (S)-}Adénosyl-L

-méthylthio-2-oxobutanoate Lys/DaPaTA ^{Diaminopélargonate + (S)-2-}_{Amino-6-oxohexanoate}

GaBaTA GaBa + KG GSalTA Glu-1-semialdéhyde + KG ASalTA Asp-1-semialdéhyde + KG Lys-ε-TA Lys + KG OrnTA Ornithine + KG SucOrnTA Succinylornithine + KG (S)-Amine-TA

(S)-AmineTA (S)-Amines + Pyr

FumTA Fumosinin B1 + Pyr

NeaTA Néamine + KG

PutreTA Putrescine + KG VanTA Vanillylamine + Pyr

IV IV

(R)-Amine-TA (R)-AmineTA (R)-Amines + Pyr Amine-TA

D-α-TA ^{D-AlaTA D-Ala + KG} _α-TA

D-AaTA D-aminoacides + KG

L-α-TA BCAT L-Leu + KG

I V L-α-TA

Ser:GlyoxTA L-Ser + Glyox/KG

α-TA

PSerTA L-Phospho-Ser + KG Ala:GlyoxTA L-Ala + Glyox/KG UreGlyTA Uréidoglycine + Glyox

I VI/VII Sugar-TA ^SugarTA (ArnB/TylB/StsC) ^--- Sugar-TA GlnSugarTA L-Gln + cétosucre

Abbréviations autre qu’aminoacide canonique : Aa = Aminoacides, Aad = Aminoadipate, AcOrn = Acétylornithine, Aro = Aminoacides aromatiques, ASal = Asp-1-semialdéhyde, BCAT = Branched chain aminoacids, DaBa = Diaminobutyrate, Dap = Diaminopimélate, DaPa = Diaminopélargonate, Fum = Fumosinin B1, GaBa = γ-Aminobutyrate, Glyox = glyoxylate, GSal = Glu-1-semialdéhyde, HisP = Histidinol-phosphate, KG = cétoglutarate, Nea = Néamine, Orn = Ornithine, Pre = Préphénate, PSer = Phosphosérine, Putre = Putrescine, SucOrn = Succinylornithine, Taur = Taurine, UreGly = Uréidoglycine, Van = Vanillylamine.