Optimisation du test couplé utilisant l’ACS

Nous avons cherché à optimiser les quantités de PLP et de PyrASTA afin de minimiser le bruit fond tout en préservant une réponse maximale et une gamme dynamique la plus large possible.

Nous avons tout d’abord quantifié l’apparition de SO2 pendant 30 min en présence de butanal et d’ACS et en testant plusieurs combinaisons de concentrations pour les 2 TA (Q7NWG4 et A4A10). Les vitesses maximales obtenues, résumées dans le Tableau 13, nous ont permis de conclure qu’une activité de 20 mUI/puits d’enzyme auxiliaire ne permet pas de mesurer une activité de 1mUI/puits d’enzyme principale (entrées 2 et 4). En effet, dans ces conditions, le signal n’est pas distinguable du bruit de fond sans TA auxiliaire. Par contre l’addition de 200 mUI/puits de A4A10 permet bien de mesurer une activité de 1 mUI/puits de Q7NWG4 (entrées 1 et 5). On peut voir aussi que le signal est bien corrélé à la quantité d’enzyme principale (entrées 4/6 et 5/7). Notre objectif lors du criblage étant de mesurer des activités ≤ 1 mUI/puits, nous avons donc opté pour une quantité de 0.2 UI/puits d’enzyme auxiliaire.

Tableau 13 : Vitesses maximales sur 30 min. (∆DOmax/min x 102) avec différentes quantités de TA. Entrée ^{TA principale} Q7NWG4 (mUI/puits) TA auxiliaire A4A10 (mUI/puits)

∆DOmax/min (x102) 1 0 200 0,85 2 1 0 0,15 3 10 0 0,15 4 1 20 0,14 5 1 200 1,38 6 10 20 0,85 7 10 200 7,51

À ce stade, nous avons établi une première courbe de calibration avec 200 mUI/puits de A4A10 et 50 µM de PLP afin d’estimer la gamme d’activité mesurable dans ces conditions. Pour cela, nous avons choisi de mesurer le temps nécessaire pour

atteindre une variation de DO (ΔDO) égale à 1, 2 ou 3 avec diverses quantités de Q7NWG4 (0,4 à 50 mUI/puits) (Graphique 12).

Graphique 12 : Temps pour atteindre une ΔDO de 1 (), 2 (), et 3 (+) à différentes [Q7NWG4].

On constate tout d’abord que la gamme de temps mesurée est bien plus large si l’on fixe une ΔDO de 3. Bien que cela apporte une meilleure résolution, le temps d’analyse nécessaire pour les petites activités est relativement long (environ 90 min). Nous avons donc préféré nous orienter vers des temps d’analyse plus courts en fixant une ΔDO aux alentours de 1. On peut constater d’autre part que ce test permet sans doute de mesurer des activités plus grandes que les tests présentés précédemment, qui étaient limités à 16 mUI/puits.

Graphique 13 : Activité des TA Q7NWG4 () et A4A10 () en fonction de la concentration en PLP. 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 Temp s (m in) Q7NWG4 (mUI/puits) 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% 0 20 40 60 act iv it é^[P LP ] /a ct iv it é^max [PLP] (µM)

Nous avons ensuite cherché à optimiser la concentration du PLP. Pour cela nous avons mesuré l’activité des deux TA avec des concentrations variables en PLP. L’activité de la A4A10 a été mesurée en présence de Pyr d’ACS et de DTNB, tandis que celle de la Q7NWG4 a été mesurée en présence de butanal et d’Ala avec le test LDH/NADH (Graphique 13).

Dans le cas de la A4A10, on observe une activité maximale dès l’addition de 5 μM de PLP, puis une légère inhibition à 50 μM. Dans le cas de la Q7NWG4, l’activité croît jusqu’à la valeur maximale testée de 50 μM. La valeur mesurée à 5 μM correspondant à environ 80 % de l’activité maximale mesurée, nous avons décidé de fixer la concentration du PLP dans nos tests à 5 μM afin de minimiser le bruit de fond lié à l’activité parasite de la A4A10.

La Figure 21 présente l’évolution de la DO à 412 nm pendant 1 h en présence d’Ala, de butanal, d’ACS, de A4A10 (200 mUI/puits), de PLP (5 μM) et de différentes quantités de Q7NWG4. Le Graphique 14 présente quant à lui les temps nécessaires pour atteindre une ΔDO de 0,75 en fonction de la quantité de Q7NWG4. Pour comparaison, des expériences similaires ont été conduites en utilisant le test LDH/NADH : la Figure 22 présente les variations de DO mesurées à 340 nm et le Graphique 15 présente la corrélation entre les quantités de Q7NWG4 et les vitesses déterminées à partir des variations linéaires de DO.

Figure 21 : DO mesurées à 412 nm avec le test couplé utilisant l’ACS et des quantités de Q7NWG4 de 0,01 à 4,1 mUI/puits (courbes A à K).

Graphique 14 : Courbe de calibration pour le test couplé utilisant l’ACS.

Figure 22 : DO mesurées à 340 nm avec le test LDH/NADH et des quantités de Q7NWG4 de 0,01 à 4,1 mUI/puits (courbes A à K)

Graphique 15 : Courbe de calibration pour le test LDH/NADH.

Bien que nous n’ayons pas déterminé des LOD de façon rigoureuse, ces résultats montrent que le test couplé utilisant l’ACS est apparemment plus sensible que le test LDH/NADH. Il permet de mesurer une activité de 0,02 mUI/puits alors que le test LDH/NADH se limite à environ 0,2 mUI/puits. Concernant la gamme dynamique, nous avons montré que le test permet de mesurer de façon fiable des activités de 4mUI/Puits. Au vu des courbes obtenues, il est vraisemblable que des activités supérieures puissent être mesurées (avec des temps nécessaires pour atteindre une ΔDO de 0,75 compris entre 0 et 8 min). Quoi qu’il en soit la gamme dynamique correspond au minimum à des rapports d’activité mesurables de 1 à 200. En conclusion, nous avons donc démontré que ce test couplé présente de bonnes performances et qu’il peut être utilisé pour le criblage de collections d’amine-TA. Cependant, comme il ne permet pas de déplacement d’équilibre il n’est vraisemblablement pas adapté pour la détection de réactions thermodynamiquement très défavorables. Par contre, pour ce type de réactions atteignant rapidement un état d’équilibre, ce test pourrait permettre, comme nous l’avons évoqué ci-dessus, d’estimer la constante d’équilibre. Par manque de temps, nous n’avons pu explorer cette potentialité.

1.1.2.4 Test couplé pour les amine-TA utilisant l’HPT et la butylamine