Une régulation en réponse aux dommages de l’ADN

2.1. Au niveau transcriptionnel

Il a été montré que le niveau du transcrit HUG1 augmentait en réponse aux dommages de l’ADN (Basrai et al., 1999). Nous l’avons identifié, quant à nous, dans une analyse transcriptomique en réponse à l’activation de RAD53. Nous avons voulu connaître la cinétique d’activation de la transcription de HUG1 en réponse aux dommages de l’ADN.

Tout d’abord, nous avons créé des souches étiquetées pour suivre, par la suite, HUG1 au niveau protéique. Puis nous avons réalisé une cinétique en présence de HU ou de 4NQO avec deux souches étiquetées (13Myc ou GFP), la souche sauvage et la souche délétée pour HUG1. Des prélèvements sont effectués toutes les heures puis le lendemain matin. Ensuite les ARNs totaux sont extraits suivant le protocole décrit dans la section « Matériels et méthodes ». Ces ARNs sont ensuite rétrotranscrits et analysés par PCR quantitative en temps réel (qPCR). Les données obtenues sont ensuite analysées et normalisées. Les analyses des Ct (cycle treshold) sont réalisées en triplicatas, tout d’abord nous moyennons les données avant de les normaliser par rapport aux données obtenues pour un gène contrôle (ACT1) : ∆ = _− _. Puis les données sont normalisées par rapport à un calibreur (nous normalisons par rapport à la souche délétée pour HUG1) : ∆∆ = ∆ _− ∆ _∆. Enfin une quantification relative est effectuée en utilisant la formule 2∆∆ avec comme prérequis que les efficacités de PCR sur les gènes HUG1 et ACT1 sont proches. On peut déjà voir que le taux de transcrits en présence de 100mM de HU est plus fort que celui en présence de 0,05μg/mL de 4NQO (Figure III2.A,B,C). Il se trouve que Benton et al. ont également mesuré de manière différente la quantité de transcrits

HUG1 en réponses à différentes intensités de stress génotoxiques et ils ont remarqué une réponse maximale de la transcription de HUG1 avec 100mM de HU et également avec 0,5µg/mL de 4NQO (Benton et al., 2007). On remarque que la quantité de transcrits présents dans la souche étiquetée 13Myc est plus importante au départ que celle de la souche étiquetée GFP (Figure III2.A,B). Mais globalement les cinétiques restent les mêmes. On atteint un pic 1-2 heures après ajout de stress génotoxiques. Puis le taux de transcrits diminue. La forte quantité de transcrits trouvés au temps 21 heures est probablement due à un problème de calibration ; le contrôle endogène choisi n’est pas adéquat pour des analyses de phase stationnaire (Teste et al., 2009). Il aurait mieux valu utiliser comme contrôle endogène, les gènes ALG9, TAF10, TFC1 ou UBC6 pour ces conditions de phase stationnaire (Teste et al., 2009).

2.2. Au niveau post-transcriptionnel

A partir de ces mêmes cinétiques, nous avions réalisé des prélèvements en vue de suivre la quantité de protéines Hug1 en réponse aux stress génotoxiques. Nous avons suivi l’expression de la protéine par western blot (Figure III3.A et B). On peut voir qu’alors que le niveau basal de Hug1, en absence de dommages à l’ADN, est à peine visible pour la souche étiquetée GFP celui-ci est très nettement observable dans la souche étiquetée 13Myc. Certes l’anticorps utilisé pour détecter le tag Myc est plus efficace néanmoins, lorsque l’on applique des stress génotoxiques l’induction semble plus faible pour la souche 13Myc que pour la souche GFP. Le signal étant saturant dans les deux cas, nous ne pouvons pas quantifier précisément le niveau d’induction. L’étiquetage semble donc avoir un effet sur la production ou la stabilité de la protéine d’où l’intérêt d’étudier la protéine endogène, c’est pourquoi nous avons choisi de produire des anticorps polyclonaux dirigés contre Hug1 (voir la section matériels et méthodes). Grâce à ces anticorps, nous avons pu voir que la protéine endogène était très fortement produite en réponse à un stress génotoxique (Figure III3.B), on peut voir également, même si le signal est plus faible, que la protéine endogène est présente même en absence de stress génotoxiques.

Figure III 2 : Cinétique d’induction de la transcription de Hug1 en présence de différents stress génotoxiques.

Les cellules sont cultivées pendant 21 heures avec 100mM de HU (en rouge) ou 0,05µg/mL de 4NQO (en vert) ou sans traitement (en bleu). Différentes souches sont utilisées pour ces analyses ; la souche sauvage (A) Hug1-GFP (B), Hug1-13Myc (C). Les ARNs totaux sont extraits et rétro transcrits avant d’être analysés par PCR quantitative en temps réel.

Il était important de contrôler si l’augmentation de la quantité des transcrits était corrélable avec la quantité de protéines produites. En effet il peut y avoir une régulation post traductionnelle favorisant la dégradation de la protéine. Ici l’induction observée par l’analyse des transcrits est également visible par analyse des protéines (Dyavaiah et al., 2011).

Figure III 3: Production de la protéine Hug1 en présence de stress génotoxique

A. Cinétique de la production de Hug1 dans différentes conditions de culture. Les cellules sont cultivées pendant 21 heures avec 100mM de HU ou 0,05µg/mL de 4NQO. Différentes souches sont utilisées pour ces analyses ; Hug1-GFP et la souche Hug1-13Myc. Les protéines sont extraites et analysées par western blot à l’aide d’anticorps anti Myc ou anti GFP

B. Induction de la protéine Hug1 endogène en présence ou non d’HU. La protéine Hug1 endogène est détectée à l’aide d’anticorps polyclonaux produits chez le lapin.

2.3. Au niveau subcellulaire

Au début de l’étude, nous ne connaissions pas la localisation subcellulaire de Hug1. Nous avons donc réalisé des analyses par immunofluorescence avec et sans stress génotoxiques (HU 100mM et 4NQO 0,05µg/mL) et avons regardé où était localisé Hug1 (Figure III4).

Figure III 4 : Visualisation de la localisation sub-cellulaire de Hug1-13Myc

Les cellules sont mises en culture en présence de 100mM de HU ou 0,05µg/mL de 4NQO durant 8 heures, puis la localisation de Hug1-13Myc est observée par immunofluorescence à l’aide d’anticorps anti-Myc.

On peut voir en absence de stress génotoxique exogène, mis à part quelques cellules (probablement dû à des dommages spontanés ou à une phase particulière du cycle), le signal correspondant à Hug1-13Myc est très faible (signe que Hug1 est continuellement présent dans la cellule mais à un faible niveau) et semble ne pas correspondre à une localisation précise dans la cellule : il y a du signal à la fois dans le cytoplasme et dans le noyau. Lorsqu’on applique un stress génotoxique on peut voir très nettement une augmentation du signal, ce dernier devient presque saturant. Dans ces conditions, on peut voir que Hug1- 13Myc se trouve majoritairement dans le cytoplasme, il pourrait y avoir une petite exclusion du noyau, peu évidente à voir et sans certitude car le signal est très fort. En conclusion on peut dire que Hug1 est préférentiellement localisé dans le cytoplasme et qu’il ne semble pas il y avoir de relocalisation massive vers le noyau en présence de stress génotoxiques.