Elaboration d’un crible double hybride à grande échelle

5.1. Principe général

Le principe du double hybride repose sur une utilisation particulière du facteur de transcription Gal4. Ce système a été décrit pour la première fois par Fields et Song en 1989 (Fields and Song, 1989). Ce facteur est constitué de deux domaines fonctionnellement indépendants, un domaine de liaison à l’ADN ou DNA Binding Domain (DBD), et un domaine d’activation de la transcription ou Activating domaine (AD). Pris séparément ces domaines ne sont plus capables d’activer la transcription du gène Gal4 (Fields and Song, 1989; Young, 1998), mais leur rapprochement physique permet de reconstituer un facteur de transcription fonctionnel. Ainsi en fusionnant le domaine Gal4-DBD à une protéine X et le domaine Gal4-AD à une protéine Y, il est possible de reconstituer un facteur de transcription Gal4 fonctionnel si les protéines X et Y interagissent, permettant la transcription de gènes rapporteurs (mis sous le contrôle de la séquence activatrice (UAS) que lie Gal4). Des marqueurs prototrophiques (LEU2 ou HIS3) sont généralement utilisés comme gènes rapporteurs car ils permettent une sélection positive sur un milieu dépourvu de l’acide aminé pour lequel la souche est devenue prototrophe (Young, 1998). Un autre moyen de sélection se fait par le biais du gène LacZ qui permet une lecture colorimétrique après réaction enzymatique. De nombreux systèmes double hybride utilisent deux gènes rapporteurs pour minimiser les « faux positifs », ce qui est notre cas, nous utilisons les gènes rapporteurs HIS3 et LacZ. Lors de cribles à grande échelle, une protéine fusionnée au domaine Gal4-DBD sert d’appât et est coexprimée avec une banque de protéines fusionnées avec le domaine Gal4-AD servant de proie.

5.2. Mise au point du crible

des fusions avec le domaine Gal4-DBD ; pGBT9, pGBKT7 et pAS∆bis. Nous avons donc inséré la séquence codante de Hug1 en 3’ du domaine de Gal4 dans chacun de ces 3 plasmides. L’expression de Hug1 est testée par western blot. On peut déjà voir une différence de comportement de l’expression de Hug1 à partir des différents plasmides (Figure III13.A). Notamment l’expression à partir du plasmide pGBT9 est très faible, celle à partir du plasmide pAS∆bis également, seule l’expression dans pGBKT7 est clairement détectée.

Figure III 13 : Mise au point du crible double hybride

A. Les plasmides Gal4-DBD dans lesquels ont été clonés la phase codante de HUG1 sont transformés dans la souche Y187 puis leur expression est testée par western blot en utilisant un anticorps dirigé contre le domaine Gal4-DBD.

B. Le niveau d’activation du promoteur UAS-Gal est évalué en test de croissance sur un milieu sélectif dépourvu d’histidine et contenant des concentrations variables de 3-AT. Le plasmide pAct2 est un plasmide contenant la partie activatrice du facteur Gal4.

Avant de réaliser le crible, il faut également tester la croissance des souches transformées sur un milieu de sélection. Le premier gène rapporteur est l’histidine, le problème est que le niveau de fuite du promoteur permet quand même aux cellules de pousser sur un milieu sans histidine. Il est donc nécessaire de supplémenté le milieu en 3AT (3-Amino- 1,2,4,triazole), un inhibiteur de l’enzyme codée par HIS3. En présence de 3AT, seules les souches produisant suffisamment de HIS3 pourront pousser (Figure III13.B). Afin de décider quelle concentration de 3AT sera nécessaire pour le crible nous réalisons une gamme de concentration. Le second gène rapporteur code la β-galactosidase.

Le plasmide pAS∆bis semble être toxique puisque les cellules ont du mal à pousser sur SD2A (Figure III13.B). En présence de 3AT, on peut voir que les cellules poussent bien que le domaine Gal4-AD ne soit fusionné à aucun partenaire de Hug1. Ceci suggère que la fusion Hug1-Gal4-DBD en se liant à l’UAS Gal4 présente une activité d’activation transcriptionnelle. Nous avons alors décidé de nous placer, pour le crible, dans les conditions de concentration en 3AT minimale pour laquelle on n’observe plus qu’une croissance résiduelle des cellules contenant le plasmide pGBT9-Hug1 (soit 25 mM de 3AT).

5.3. Réalisation du crible utilisant Gal4DBD-Hug1 comme appât

Pour le crible, nous utilisons comme proie une banque d’ADN permettant de couvrir l’intégralité du génome de S. cerevisiae sous forme de fragments aléatoires (banque FRYL (Fromont-Racine et al., 1997)). Cette banque a été introduite par transformation dans la souche Y190 (Aucher et al., 2010). Le crible est ensuite effectué comme décrit dans la section « Matériels et méthodes ». Nous avons pu estimer le nombre de diploïdes testé à 8,064.106 ce qui équivaut à une couverture de la banque de 80%. Les clones apparaissant sur les boîtes de sélection sont ensuite restriés sur SD2A+3AT 25mM pour vérifier qu’ils sont bien capables de pousser en présence de cette concentration de 3AT, puis des tests colorimétriques d’activité de la β-Galactosidase sont effectués. Parmi les 235 clones isolés seulement 15 (tableau III2) se sont avérés positifs pour tous les tests effectués. Pour ces clones, le fragment génomique inséré en fusion avec Gal4AD a été amplifié par PCR puis séquencé.

Globalement on peut noter une forte diversité quant à la fonction des protéines identifiées (réplication/réparation de l’ADN, protéine de structure ou protéines impliquées dans le trafic membranaire…), nous avons même trouvé des fragments correspondant à des intergènes, sans doute reste-t-il des protéines à découvrir.

Le fragment le plus fréquemment isolé se trouve être une partie de la protéine Dna2 (voir paragraphe 2), une enzyme qui possède des activités hélicase et endonucléase et qui est notamment impliquée dans la résolution des fragments d’Okazaki (Bae and Seo, 2000).

On retrouve aussi plusieurs fois un fragment appartenant à la protéine Pkh2. Cette protéine est une Sérine/thréonine kinase impliquée dans les voies de signalisation des sphingolipides (Roelants et al., 2002). Pkh2 joue un rôle redondant avec une autre protéine kinase Pkh1

(Roelants et al., 2002). Ces kinases participent à l’activation des protéines Ypk1, Ypk2 et Pkc1 qui sont des protéines notamment impliquées dans l’endocytose (Dickson et al., 2006). Pkc1 peut aussi être activé par une autre voie de signalisation impliquant les protéines Rom1 et Rom2 (trouvé également dans le crible à grande échelle) (Dickson et al., 2006). De manière intéressante, nous avons trouvé dans le crible, une autre protéine impliquée dans l’endocytose ; Ypp1. Cette protéine joue un rôle essentiel dans la signalisation des phosphoinositides au niveau de la membrane plasmique (Zhai et al., 2008).

Tableau III 2 : Fragments de gènes isolés lors du crible double hybride

Le nom du gène identifié ainsi que ses coordonnées génomiques sont indiquées. Les occurrences correspondent au nombre de fois que le gène est identifié au cours du crible double hybride.

Nous trouvons également plusieurs fois un fragment correspondant à la protéine Tid3 (plus communément appelé Ndc80). Cependant il se trouve que cette protéine est couramment retrouvée dans les cribles doubles hybrides effectués au laboratoire ce qui laisse supposer que cette dernière serait un autoactivateur (faux positif).