Ultra-filtration frontale agitée

Une autre méthode utilisée pour réaliser le fractionnement physique d’un amidon en solution est l’ultra-filtration frontale agitée. L’amidon possédant une très grande distribution de masse, l’utilisation successive de « tamis » de tailles différentes permet d’isoler des fractions ayant des distributions en masse plus restreintes [101, 103]

. Dans le même temps, les ultraconcentrats sont enrichis en macromolécules de tailles plus importantes par élimination des plus petites. Les membranes d’ultra-filtration disponibles commercialement sont calibrées sur des protéines globulaires dont la taille (rayon de giration) est fonction de leur masse. De ce fait, leur seuil de coupure sera exprimé en kilodaltons (KDa), équivalent à la masse des plus petites protéines qu’elles peuvent retenir.

a) Conditions de solubilisation

Afin de pouvoir réaliser ce type de filtration, il faut dans un premier temps parfaitement solubiliser l’amidon. C’est pourquoi une étude sur les meilleures conditions de concentration et de solubilisation à utiliser est nécessaire en amont de toute filtration. L’utilisation du DMSO étant délibérément refusée (dans un souci de facilité de récupération des fractions), la solubilisation de l’amidon de blé en milieu aqueux basique est retenue. En fin de protocole, une simple neutralisation au CO₂, une congélation suivie d’une lyophilisation permet de récupérer simplement la matière. Il faut donc prendre en compte la concentration massique maximale en amidon pour une concentration en soude donnée. Il apparaît que pour des volumes importants (de l’ordre de 2,5 l), l’utilisation de solutions de 20 à 30 g/l en amidon pour des concentrations de 0,1 à 0,5 mol/l en soude permet une solubilisation rapide conduisant à des solutions limpides.

b) Taille des pores

Dans un second temps, il faut établir la (ou les) taille(s) de pore(s) adéquate(s) à la filtration.

Après de nombreuses tentatives partant d’un seuil de coupure faible pour remonter jusqu’à un seuil de coupure pouvant permettre effectivement un fractionnement, il apparaît que pour toutes les membranes allant de 1 KDa jusqu’à 500 Kda, la totalité de l’amidon est retenue. Les membranes de seuils supérieurs, disponibles commercialement, ne sont pas exprimés en seuil de coupure massique mais en diamètre moyen de pores. Les membranes disponibles, de tailles de pores 0,2, 0,45 et 1 µm ont donc été utilisées pour cette étude. Il s’agit de tamis au sens propre du terme puisque la taille des pores est cette fois bien définie et mesurable par microscopie optique. On parle alors de microfiltration.

Ultraconcentrats

% exprimés par rapport à la somme des masses totales d’ultraconcentrats

Tableau 10 : Résultats des fractionnements issus de l’ultra-filtration (La somme des masses obtenues supérieure à la masse introduite correspond à la fraction minérale Na2CO3 résiduelle

après lyophilisation) gélatinisation réalisée préalablement à l’ultra-filtration permettent d’obtenir un meilleur fractionnement des macromolécules. Celui-ci restant trop faible (maximum < 10%) le passage sur une membrane dont le seuil de coupure est de 1µm est nécessaire. Malheureusement, dans ces nouvelles conditions, le fractionnement reste très faible.

Une étude par RMN des fractions issues de AS0,5 révèle un taux de branchement de 3,5% pour la fraction majoritaire alors que pour la fraction passée au travers de la membrane, le taux n’est que de 2,4%. Cela traduit un passage préférentiel de macromolécules ayant un taux de branchement plus faible au travers de la membrane, ce qui peut être mis en relation avec une

taille des macromolécules plus faible et donc une masse plus faible comme celle des amyloses et d’amylopectines de faible masse.

c) Conclusion

Une solution d’amidon gélatinisé étant une suspension de résidus de granules gonflés (agrégats) et de macromolécules solubilisées (essentiellement l’amylose), il se peut que ces agrégats ne soient pas détruits lors de la mise en solution, même à forte concentration de soude, engendrant de fait un mauvais fractionnement. Pour remédier à cela, un test a été réalisé avec une solution d’amidon déstructuré diluée avec une solution de DMSO / (10% p/p) LiCl ^[104], mais la très forte viscosité de la solution n’a pas permis un écoulement correct du solvant (tableau 10). Par ailleurs, le produit n’a pu être lyophilisé car il n’a pas pu être congelé dans des conditions classiques à -20°C.

Les seuils de coupure utilisés étant très nettement supérieurs à la taille des macromolécules, même des plus grandes, on ne peut pas mettre en relation, de façon claire, la taille des pores et la masse ou la taille des macromolécules retenues par le filtre même s’il semble que les taux de branchement des fractions concentrées et filtrées aillent dans le bons sens en postulant que les macromolécules les plus ramifiées sont les plus lourdes et les plus longues.

A posteriori, la méthode de séparation physique de l’amidon en solution, soit par précipitation fractionnée ou par ultrafiltration, est critiquable. La méthode de caractérisation par mesure de la viscosité relative a montré ses limites pour le cas des macromolécules amylacées. De plus, la précipitation fractionnée joue sur la solubilité des plus grosses macromolécules dans leur milieu. Or de grandes difficultés de solubilisation ont été rencontrées initialement. Ainsi, il est envisageable que la solubilisation n’est en réalité que partielle et certainement très « fragile ».

Par conséquent, l’ajout d’éthanol qui provoque une très légère modification du milieu voit son impact sur la solubilité de l’amidon beaucoup plus important que s’il s’agissait de molécules parfaitement solubles. Cette analyse tend à être confirmée par l’ultra-filtration frontale agitée.

Par cette méthode, il a été mis en évidence que globalement les fractions retenues correspondent à des agrégats puisque la taille des pores est très nettement supérieure à la taille des molécules malgré des conditions de solubilisation apparemment correctes.

Il est donc envisageable que les conditions de solubilisation ne soient pas suffisantes pour mettre en place une séparation efficace, à une échelle importante, des macromolécules d’amidon lorsqu’elles sont en solution. Le fait de réaliser ce fractionnement à une grande échelle est essentiel puisque l’objectif final est de réaliser des tests mécaniques sur les fractions qui auraient du être obtenues. Or pour réaliser ces tests mécaniques, des quantités importantes, sont nécessaires (de l’ordre de la dizaine de grammes).

De ce fait, une méthode de fractionnement à sec des amidons natifs sous forme de poudre a été envisagée. Par ailleurs, cette technique permettra peut-être d’apporter quelques réponses sur une organisation structurale particulière des grains en fonction de la population des macromolécules qui les composent.