caractérisation des mutants chez S. cerevisiae :
La transformation de levure se réalise sur deux jours, le premier est utilisé pour faire
une culture overnight de 10 ml dans du milieu YPD (extrait de levure 1 %, peptone 2 %
et D-glucose) à 30 °C sous agitation 190 rpm. Le lendemain matin un aliquot est
récupéré afin de déterminer la densité optique de la culture. Une fois la valeur connue,
50 ml de YPD à une DO de 0,2 sont ensemencés et incubés dans les mêmes conditions
que précédemment. Lorsque la DO est comprise entre 0,6 et 1 (début de la phase
exponentielle), les cellules sont centrifugées (4000 rpm pendant 10 min à température
ambiante) afin d'éliminer le surnageant puis resuspendues dans 300 µl d'eau distillée.
Pour chaque transformation 500 ng de plasmide, 50 µl de levures et 272 µl de lithium
acétate/PEG 4000 (240 µl de solution PEG 50 % poids/volume plus 32 µl de lithium
acétate 1 M) sont mélangés et mis à incuber à 30 °C pendant 30 min. Il s'en suit un choc
thermique de 15 min à 45 °C.
125
Les cellules sont lentement centrigugées à 2000 rpm (température ambiante) pendant 2
min le culot est resuspendu dans 200 µl d'eau. 100 µl sont inoculés par boite de pétri
contenant un milieu de sélection Yeast nitrogen base (YNB 0.675 %, drop out 0,192 %,
glucose 2 % et agar si solide 2 %) (Auxotrophie à l'uracile) puis incubés à 30 °C.
1. Western-blotting :
1.1 Préparation des cellules :
Une culture sur la nuit de 10 ml d’YNB est réalisée et incubée à 30 °C sous agitation.
Cette dernière est utilisée pour ensemencer à une DO de 0,2 un volume de 50 ml d’YNB
Lorsque la DO atteint une valeur de 0,6, les cellules sont centrifugées à 4000 rpm durant
10 min à température ambiante. Le milieu YNB est éliminé puis remplacé par du YNB
galactose car le gène codant la protéine d'intérêt est contrôlé par un promoteur
inductible au galactose. La culture est ensuite mise sous agitation à 30 °C pendant une
nuit, puis les cellules sont resuspendues dans 1 ml d'eau stérile. La première étape de
l'extraction de protéines chez la levure consiste à lyser ces cellules par choc thermique.
Ces dernières sont placées dans un bain d'azote liquide pendant 30 secondes puis 5 min
à 70 °C. La solution est ensuite vortexée en présence de microbilles. Cette opération est
répétée quatre fois.
1.2 Extraction protéique :
Un tampon d'extraction protéique (Tris-HCl 1 M pH 8 5 %, ß-mercaptoethanol 14,3 M,
PMSF 100 mM) est ajouté dans l'échantillon biologique préalablement lysé. La quantité
de ce dernier est ajusté en fonction du volume de la solution de levure (application d'un
facteur quatre). Les échantillons sont ensuite placés à 4 °C sous agitation puis
centrifugés à 15 000 rpm pendant 20 min. Le surnageant contenant les protéines
solubles est récupéré puis repris dans de l'acétone glacial 100 % (1 ml de protéine pour
4 ml d'acétone) et stocké à -20 °C. Pour extraire les protéines membranaires, le culot est
resuspendu dans 1 ml de solution d'extraction membranaire (Tris-HCl 1 M pH 8 5 % et
SDS 10 %) puis les échantillons sont placés à 4 °C sous agitation et centrifugés à 15 000
rpm pendant 20 min. Le surnageant est collecté et stocké comme décrit précédemment.
127
1.3 Western blot :
Le western blot est une technique utilisée afin d'identifier une protéine de façon
spécifique au sein d'un échantillon biologique. La première étape consiste à réaliser une
migration lente (120 V) des protéines sur un gel SDS-PAGE 15 % et de 1 mm d'épaisseur.
Au préalable, il est important de chauffer les échantillons protéiques dans du tampon
Laemmli 10 min à 95 °C. Lorsque la migration est terminée, le transfert des protéines
sur une membrane de nitrocellulose est réalisé dans une solution de transfert (Tris 25
mM, glycine 192 mM et méthanol 10 %) pendant 1 h à 100 V. Ensuite, il est essentiel de
bloquer les sites libres non spécifiques de la membrane avec 10 ml d'une solution de
blocage (Odyssey blocking buffer) pendant une nuit à 4 °C sous agitation. Ceci afin
d'éviter une fixation aspécifique de l'anticorps sur les sites libres. Après cette étape, 10
µl d'anticorps primaire (1/1000 ème) et 5 µl de tween 20 sont ajoutés directement dans
la solution de blocage. L'incubation se fait pendant 2 h à température ambiante et sous
agitation. Quatre lavages de 10 min sont ensuite effectués avec 10 ml d'une solution de
PBS-tween (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM, Tween
20 500 µl et H2O miliQ Qsp 1 L). Une fois cette étape terminée, la membrane est à
nouveau placée dans 10 ml de solution de blocage, 2 µl d'anticorps secondaire
(1/5000ème), 5 µl de tween 20 et 5 µl de SDS 20 % pendant 2 h à température
ambiante, sous agitation et à l'obscurité. Avant révélation de la membrane il est
nécessaire de réaliser trois lavages avec du PBS tween 1X et trois lavages avec du PBS
1X. La révélation se fait grâce à un scan infrarouge de chez Li-cor (odyssey).
2. Localisation cellulaire par imagerie au microscope confocal :
Suite à la transformation génétique, un plasmide contenant une fusion protéique a été
introduit chez la levure. L’expression de cette construction est régie par un promoteur
inductible au galactose. C’est pourquoi, il est nécessaire de réaliser une induction avec
du milieu YNB enrichi en galactose. Dans notre cas, cette étape a été réalisée sur des
levures en phase exponentielle (DO de 0,6) durant 15 h à 30 °C sous agitation. La culture
étant effectuée en milieu liquide, il suffit donc de déposer une goutte de culture sur une
lame en verre puis de l’observer afin de déterminer une localisation cellulaire.
128
Nom Séquence 5' 3' Région amplifiée
Pa_2-3860-A GAG TTG TTG GTT GTA GGT TTG ATG GGG AGT
Amont du gène Pa_2-3860
Pa_2-3860-B CTA TTT AAC GAC CCT GCC CTG AAC CGA ACG CAA GGT AGG TAT GAT GAG AAG GGA TG
Pa_2-3860-C CTT ACC GCT GTT GAG ATC CAG TTC GAT GGT GGA AGT TGG TGG GAG CGT TAG GGA AAGG
Aval du gène Pa_2-3860
Pa_2-3860-D ATT CGT AAC AGA TCC GTT GTT CGA GGC CGG
Pa_2-3860-E CAT CCC TTC TCA TCA TAC CTA CCT TGC GTT CGG TTC AGG GCA GGG TCG TTA AAT AG
Hygromycine Pa_2-3860
Pa_2-3860-F CCT TTC CCT AAC GCT CCC ACC AAC TTC CAC CAT CGA ACT GGA TCT CAA CAG CGG TAA G
Pa_6-2010-A GAC TGA TAA CCT CAA CAG CGC TTT CTT GTC
Amont du gène Pa_6-2010
Pa_6-2010-B CTA TTT AAC GAC CCT GCC CTG AAC CGC GAA ACT TAC CCC TCA AGT GAC GAG AAA TC
Pa_6-2010-C CTT ACC GCT GTT GAG ATC CAG TTC GAT GGT TCT TGG AGG ACT TTG AGG CTT AAG CAA G
Aval du gène Pa_6-2011
Pa_6-2010-D CTC AAC TTT CTT CGG AAC ACT TGG GAA TCT
Pa_6-2010-E GAT TTC TCG TCA CTT GAG GGG TAA GTT TCG CGG TTC AGG GCA GGG TCG TTA AAT AG
généticine Pa_6-2010
Pa_6-2010-F CTT GCT TAA GCC TCA AAG TCC TCC AAG AAC CAT CGA ACT GGA TCT CAA CAG CGG TAA G
Pa_1-5100-A ATG GTT CTT ACC TAT GGT TGG AGC GTT GTC
Amont du gène Pa_1-5100
Pa_1-5100-B CTA TTT AAC GAC CCT GCC CTG AAC CGG AGG GTT GAG AGT AGC TGT CAT CTT GTT CG
Pa_1-5100-C CTT ACC GCT GTT GAG ATC CAG TTC GAT GAG GCG TTC TGG TAG ACC TTG GTA GAT GTG G
Aval du gène Pa_1-5101
Pa_1-5100-D GTC GAA GCT AGG GAT TTG TGT TTG CGG TTT TAT C
Pa_1-5100-E CGA ACA AGA TGA CAG CTA CTC TCA ACC CTC CGG TTC AGG GCA GGG TCG TTA AAT AG
généticine Pa_1-5100
Pa_1-5100-F CCA CAT CTA CCA AGG TCT ACC AGA ACG CCT CAT CGA ACT GGA TCT CAA CAG CGG TAA G
Pa_5-3780-A GTT CAA GAT TGA CAT ACG AAG ATC GGA CCA
Aval du gène Pa_5-3780
Pa_5-3780-B CTA TTT AAC GAC CCT GCC CTG AAC CGG ATG AGG AGA AAA AGA GAG TCG GCC AAA GT
Pa_5-3780-C CTT ACC GCT GTT GAG ATC CAG TTC GAT GCA TCT TAT TTC CCC TAT CAT ACC CCC TTG C
Amont du gène Pa_5-3781
Pa_5-3780-D CAC ATC AAC CCT CAT CAT CAG AAA CCA TC
Pa_5-3780-E ACT TTG GCC GAC TCT CTT TTT CTC CTC ATC CGG TTC AGG GCA GGG TCG TTA AAT AG
hygromycine Pa_5-3780
Pa_5-3780-F GCA AGG GGG TAT GAT AGG GGA AAT AAG ATG CAT CGA ACT GGA TCT CAA CAG CGG
129
Dans le document
Caractérisation fonctionnelle de petites protéines sécrétées chez les champignons lignolytiques
(Page 143-149)