Transfert des protéines sur membrane

V. Les contre- mesures à l’atrophie musculaire résultante de l’hypoxie

VI.3. Transfert des protéines sur membrane

A la suite de la séparation des protéines par électrophorèse, l’étape de transfert des protéines

a été réalisée avec le système Trans Blot Turbo sur des membranes de nitrocellulose (Trans-Blot

Turbo™, Biorad). Le transfert a été réalisé grâce à un montage type sandwich constitué de papier

Whatman trempé dans le tampon de transfert (Tampon de transfert Biorad, éthanol et eau ultra pure),

du gel contenant les protéines séparées lors de la migration, d’une membrane en nitrocellulose et le

tout a été maintenu à l’intérieur d’une cassette. Le transfert semi-sec a été effectué pendant 7, 10 ou

12 minutes à 25V en fonction du poids moléculaire de la protéine cible (Tableau II). A noter que lors

de chaque étape du montage, il a été important d’éliminer toute bulle pouvant se former entre le gel

et la membrane. La technologie Stain-free nous permet de vérifier la qualité de transfert des protéines

du gel sur la membrane. La visualisation du protéome sur la membrane et l’absence de bandes

protéiques sur le gel, nous assurent d’un transfert de qualité.

Protéine d'intérêt Masse moléculaire (kDa) % gels (acrylamide) Quantité protéine (µg) Transfert temps/voltage

Durée (min) Voltage (V)

AMPK (Thr172) 62 7,5 20 10 25 Akt (ser473) 60 7,5 20 10 25 GSK-3β (Ser9) 46 7,5 20 7 25 HIF-1α 120 7,5 20 12 25 FoxO1 (Ser 256) 82 7,5 20 10 25 FoxO3a (Ser 253) 97 7,5 20 10 25 LC3 14-16 12 20 7 25 mTOR (Ser2448) 289 7,5 20 12 25 Myostatine 50 10 20 7 25 p70S6K1 (Thr389) 70 10 20 10 25 REDD1 28 12 20 7 25

Ubiquitine (P4D1) Profile total 10 20 10 25

Tableau II : Conditions d’électrophorèse et de transfert sur membranes utilisées, optimisées pour

chaque anticorps utilisé dans cette étude.

VI.4.2. Etape d’incubation des anticorps primaires et secondaires

Les membranes ont été incubées sur un agitateur à rouleaux à vitesse lente à 4°C pendant la

nuit ou 2 heures à température ambiante avec un anticorps primaire spécifique à la protéine étudiée,

dilué dans la solution de blocage à la concentration adéquate (Tableau III). Trois lavages de 10-15

minutes ont été effectués avec une solution de TBS-T à température ambiante, puis les membranes

ont été incubées en présence d’un anticorps secondaire spécifique à l’anticorps primaire dilué dans la

solution de saturation pendant 2 heures à température ambiante (Tableau III). Par la suite, les

membranes ont été rincées dans une solution de TBS-T à cinq reprises pendant 10 minutes.

L’anticorps secondaire utilisé est couplé à une enzyme, la peroxydase, permettant de détecter

les protéines ciblées par chemiluminescence. Les membranes ont été incubées avec une solution de

détection ECL Clarity (Biorad), initiant la réaction catalytique de la peroxydase en présence de son

substrat, le luminol, et d’eau oxygénée, produisant ainsi un signal lumineux. Les membranes ont été

enveloppées d’un film transparent et déposées dans un imageur ChemiDoc MP pour l’acquisition des

images. L’ensemble des protocoles expérimentaux par Western blot ont été optimisés pour la totalité

des anticorps utilisés.

VI.4.3. Quantification du signal

L’ensemble des images obtenues ont été analysées et quantifiées par l’intermédiaire du

logiciel Image Lab (Biorad). Les signaux protéiques ont été normalisés à la fois sur la quantification du

protéome total acquis par SF et sur le signal d’un témoin interne permettant de supprimer de possibles

variations inter-expérimentations. De plus, l’intensité moyenne du bruit de fond a été soustraite de la

valeur mesurée pour chaque échantillon (Gürtler et al., 2013).

VI.4.4. Décrochage de l’anticorps primaire

Les membranes dont les protéines nécessitent une analyse de leurs formes phosphorylées et

totales ont été déshybridées avec une solution de Western Reprobe (G-Biosciences) pendant 25

minutes à température ambiante. Les membranes ont été lavées trois fois 10 minutes au TBS-T, puis

saturées avec une solution de blocage avant incubation de l’anticorps primaire spécifique à la forme

d'intérêt _Référence _Source _Type _Dilution

Tampon/Temps ^Incubation ^Référence ^Source ^Dilution Tampon/Temps ^Incubation

Phospho-AMPKα

(Thr172) ^{Cell Sig 2531} ^Rabbit ^Polyclonal ^1/1000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T

à T.A ^{Cell Sig 7074} ^Rabbit ^1/2000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T à T.A

AMPKα Cell Sig 2532 Rabbit Polyclonal 1/2000 TBST + 5% lait ^{2h sur R.T}

à T.A ^{Cell Sig 7074} ^Rabbit ^1/5000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T à T.A

Phospho-Akt (ser473) Cell Sig 9271 Rabbit Polyclonal 1/1000 TBST + 5% lait ^{2h sur R.T}

à T.A ^{Cell Sig 7074} ^Rabbit ^1/2000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T à T.A

Akt (pan) (11E7) Cell Sig 4685 Rabbit Polyclonal 1/2000 TBST + 5% lait ^{2h sur R.T}

à T.A ^{Cell Sig 7074} ^Rabbit ^1/5000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T à T.A

Phospho-GSK-3β (Ser9) Cell Sig 9336 Rabbit Polyclonal 1/2000 TBST + 5% lait ^{2h sur R.T}

à T.A ^{Cell Sig 7074} ^Rabbit ^1/5000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T à T.A GSK-3β (27C10) Cell Sig 9315 Rabbit Polyclonal 1/5000 TBST + 5% lait ^{2h sur R.T}

à T.A ^{Cell Sig 7074} ^Rabbit ^{1/10 000} ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T à T.A

HIF-1α ^Bethyl

A300-286A ^Rabbit ^Polyclonal ^1/1000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T

à T.A ^{Cell Sig 7074} ^Rabbit ^1/2000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T à T.A Phospho-FoxO1 (Ser

256) ^{Cell Sig 9461} ^Rabbit ^Polyclonal ^1/1000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T

à T.A ^{Cell Sig 7074} ^Rabbit ^1/2000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T à T.A

FoxO1 (C29H4) Cell Sig 2880 Rabbit Monoclonal 1/2000 TBST + 5% lait ^{2h sur R.T}

à T.A ^{Cell Sig 7074} ^Rabbit ^1/5000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T à T.A Phospho-FoxO3a (Ser

253) ^{Cell Sig 9466} ^Rabbit ^Polyclonal ^1/1000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T

à T.A ^{Cell Sig 7074} ^Rabbit ^1/2000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T à T.A

FoxO3a (75D8) Cell Sig 2497 Rabbit Monoclonal 1/2000 TBST + 5% lait ^{2h sur R.T}

à T.A ^{Cell Sig 7074} ^Rabbit ^1/5000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T à T.A

LC3 A/B Cell Sig 4108 Rabbit Polyclonal 1/5000 TBST + 5% lait ^{2h sur R.T}

à T.A ^{Cell Sig 7074} ^Rabbit ^{1/10 000} ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T à T.A Phospho-mTOR

(Ser2448) ^{Cell Sig 2971} ^Rabbit ^Polyclonal ^1/1000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T

à T.A ^{Cell Sig 7074} ^Rabbit ^1/2000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T à T.A

mTOR Cell Sig 2972 Rabbit Polyclonal 1/2000 TBST + 5% lait ^{2h sur R.T}

à T.A ^{Cell Sig 7074} ^Rabbit ^1/5000 ^{TBST + 5% lait}

2h sur R.T à T.A

Myostatine (GDF8) ^{Prot Tec}

19142-1-AP ^Rabbit ^{Polyclonal 1/1000 TBST + 5% lait}

2h sur R.T

à T.A

Cell Sig 7074 Rabbit 1/2000 TBST + 5% lait

^{2h sur R.T}_{à T.A}

Phospho-P70S6K1

(Thr389) ^{Cell Sig 9205} ^Rabbit ^{Polyclonal 1/1000 TBST + 5% lait}

2h sur R.T

Tableau III : Conditions d’incubation des anticorps primaires et secondaires. R.T (rouleau tournant) ; T.A (température embyante)

Protéine d'intérêt

Anticorps primaires Anticorps secondaires

Référence Source Type Dilution ^Saturation

Tampon/Temps ^Incubation ^Référence ^Source ^Dilution

Saturation

Tampon/Temps ^Incubation

P70S6K1 Cell Sig 9202 Rabbit Polyclonal 1/2000 TBST + 5% lait

^{2h sur R.T}_{à T.A}

Cell Sig 7074 Rabbit 1/5000 TBST + 5% lait

^{2h sur R.T}_{à T.A}

REDD1 ^{Prot Tec}

10638-1-AP ^Rabbit ^{Polyclonal 1/1000 TBST + 5% lait}

2h sur R.T

à T.A

Cell Sig 7074 Rabbit 1/2000 TBST + 5% lait

^{2h sur R.T}_{à T.A}

Ubiquitine (P4D1) Cell Sig 3936 Mouse Monoclonal 1/2000 TBST + 5% lait

^{2h sur R.T}

à T.A

Cell Sig 7076 Mouse 1/5000 TBST + 5% lait

^{2h sur R.T}

Dans le document Mise en place de contre-mesures pour limiter la perte protéique de cellules musculaires squelettiques consécutive à l’hypoxie cellulaire (Page 105-109)

V. Les contre- mesures à l’atrophie musculaire résultante de l’hypoxie

VI.3. Transfert des protéines sur membrane

A la suite de la séparation des protéines par électrophorèse, l’étape de transfert des protéines

a été réalisée avec le système Trans Blot Turbo sur des membranes de nitrocellulose (Trans-Blot

Turbo™, Biorad). Le transfert a été réalisé grâce à un montage type sandwich constitué de papier

Whatman trempé dans le tampon de transfert (Tampon de transfert Biorad, éthanol et eau ultra pure),

du gel contenant les protéines séparées lors de la migration, d’une membrane en nitrocellulose et le

tout a été maintenu à l’intérieur d’une cassette. Le transfert semi-sec a été effectué pendant 7, 10 ou

12 minutes à 25V en fonction du poids moléculaire de la protéine cible (Tableau II). A noter que lors

de chaque étape du montage, il a été important d’éliminer toute bulle pouvant se former entre le gel

et la membrane. La technologie Stain-free nous permet de vérifier la qualité de transfert des protéines

du gel sur la membrane. La visualisation du protéome sur la membrane et l’absence de bandes

protéiques sur le gel, nous assurent d’un transfert de qualité.

Tableau II : Conditions d’électrophorèse et de transfert sur membranes utilisées, optimisées pour

chaque anticorps utilisé dans cette étude.

VI.4.2. Etape d’incubation des anticorps primaires et secondaires

Les membranes ont été incubées sur un agitateur à rouleaux à vitesse lente à 4°C pendant la

nuit ou 2 heures à température ambiante avec un anticorps primaire spécifique à la protéine étudiée,

dilué dans la solution de blocage à la concentration adéquate (Tableau III). Trois lavages de 10-15

minutes ont été effectués avec une solution de TBS-T à température ambiante, puis les membranes

ont été incubées en présence d’un anticorps secondaire spécifique à l’anticorps primaire dilué dans la

solution de saturation pendant 2 heures à température ambiante (Tableau III). Par la suite, les

membranes ont été rincées dans une solution de TBS-T à cinq reprises pendant 10 minutes.

L’anticorps secondaire utilisé est couplé à une enzyme, la peroxydase, permettant de détecter

les protéines ciblées par chemiluminescence. Les membranes ont été incubées avec une solution de

détection ECL Clarity (Biorad), initiant la réaction catalytique de la peroxydase en présence de son

substrat, le luminol, et d’eau oxygénée, produisant ainsi un signal lumineux. Les membranes ont été

enveloppées d’un film transparent et déposées dans un imageur ChemiDoc MP pour l’acquisition des

images. L’ensemble des protocoles expérimentaux par Western blot ont été optimisés pour la totalité

des anticorps utilisés.

VI.4.3. Quantification du signal

L’ensemble des images obtenues ont été analysées et quantifiées par l’intermédiaire du

logiciel Image Lab (Biorad). Les signaux protéiques ont été normalisés à la fois sur la quantification du

protéome total acquis par SF et sur le signal d’un témoin interne permettant de supprimer de possibles

variations inter-expérimentations. De plus, l’intensité moyenne du bruit de fond a été soustraite de la

valeur mesurée pour chaque échantillon (Gürtler et al., 2013).

VI.4.4. Décrochage de l’anticorps primaire

Les membranes dont les protéines nécessitent une analyse de leurs formes phosphorylées et

totales ont été déshybridées avec une solution de Western Reprobe (G-Biosciences) pendant 25

minutes à température ambiante. Les membranes ont été lavées trois fois 10 minutes au TBS-T, puis

saturées avec une solution de blocage avant incubation de l’anticorps primaire spécifique à la forme

Myostatine (GDF8) Prot Tec

19142-1-AP Rabbit Polyclonal 1/1000 TBST + 5% lait

Cell Sig 7074 Rabbit 1/2000 TBST + 5% lait

Phospho-P70S6K1

(Thr389) Cell Sig 9205 Rabbit Polyclonal 1/1000 TBST + 5% lait

Tableau III : Conditions d’incubation des anticorps primaires et secondaires. R.T (rouleau tournant) ; T.A (température embyante)

P70S6K1 Cell Sig 9202 Rabbit Polyclonal 1/2000 TBST + 5% lait

Cell Sig 7074 Rabbit 1/5000 TBST + 5% lait

REDD1 Prot Tec

10638-1-AP Rabbit Polyclonal 1/1000 TBST + 5% lait

Cell Sig 7074 Rabbit 1/2000 TBST + 5% lait

Ubiquitine (P4D1) Cell Sig 3936 Mouse Monoclonal 1/2000 TBST + 5% lait

Cell Sig 7076 Mouse 1/5000 TBST + 5% lait

Myostatine (GDF8) ^{Prot Tec}

19142-1-AP ^Rabbit ^{Polyclonal 1/1000 TBST + 5% lait}

(Thr389) ^{Cell Sig 9205} ^Rabbit ^{Polyclonal 1/1000 TBST + 5% lait}

REDD1 ^{Prot Tec}

10638-1-AP ^Rabbit ^{Polyclonal 1/1000 TBST + 5% lait}