! Figure 5 Représentation schématique du complexe de translocation Par souci de
3. Chaperones et protéines d’export spécifiques des RCPGs
3.4 Transfert d’énergie de resonance de bioluminescence (BRET)
Le transfert non-radiatif d’énergie entre une molécule donneuse et une molécule acceptrice d’énergie est utilisé depuis plusieurs années afin d’étudier les interactions protéines-protéines. Lorsque le donneur d’énergie est fluorescent, il est excité par un faisceau lumineux à une longueur d’onde donnée et transmet de l’énergie à une autre longueur d’onde qui peut être absorbée par la molécule acceptrice. On parle alors de transfert d’énergie de résonance de fluorescence (FRET). Lorsque le donneur d’énergie est un enzyme bioluminescent, la luciferase de renilla, qui dégage de l’énergie par oxydation de son substrat, le transfert d’énergie est alors nommé BRET, pour transfert d’énergie de
résonance de bioluminescence. L’efficacité du transfert d’énergie dépend du chevauchement des spectres d’émission du donneur et d’excitation de l’accepteur, de l’orientation des dipôles donneur-accepteur et de la distance qui les sépare, qui doit être inférieure à 100 Å pour que le transfert puisse avoir lieu [531]. L’efficacité du transfert est inversement proportionnelle à la puissance 6 de la distance [532] ce qui fait du transfert d’énergie de résonance un excellent système pour l’étude d’interactions protéiques. Donc, un signal de BRET ou de FRET généré par une protéine fusionnée à un donneur d’énergie et une autre protéine fusionnée à un accepteur d’énergie est le reflet de la proximité entre ces deux protéines (Figure 9).
! Figure 9. Représentation schématique du BRET. En haut, les protéines fusionnées à la Rluc et à la YFP ne sont pas à proximité et le spectre d’émission correspond à celui de la luciferase. En bas, les deux protéines sont à proximité et il y a transfert d’énergie de la Rluc à la YFP et l’apparition d’un deuxième pic d’émission.
Cette proximité peut être causée par une interaction directe entre les deux protéines ou par une interaction indirecte par l’intermédiaire de la formation d’un complexe avec
d’autres protéines. Dans certains cas, la concentration des deux protéines dans un compartiment cellulaire pourrait favoriser des collisions aléatoires entre ces molécules et mener à la production d’un signal de BRET ou de FRET non-spécifique. Il existe différentes façons de distinguer entre interactions spécifiques et non-spécifiques qui seront décrites dans la discussion.
Les principaux avantages du BRET sur le FRET sont liés à l’élimination des problèmes associés au photoblanchiement du signal, à l’auto-fluorescence des cellules et à l’excitation simultanée du donneur et de l’accepteur par le faisceau lumineux. En effet, contrairement au FRET, le BRET ne requiert pas de stimulation lumineuse qui peut causer les problémes mentionnés ci-dessus.
!
Objectifs&de&la&thèse&
Les récepteurs couplés aux protéines G représentent une classe importante de cibles pharmacologiques et sont par conséquent l’objet de multiples recherches afin de comprendre leur mécanisme de régulation. Cependant, bien que l’expression à la membrane plasmique de la majorité des RCPGs soit essentielle à leurs fonctions, la synthèse des récepteurs dans le reticulum endoplasmique et leur transport jusqu’à la membrane plasmique sont des aspects de leur fonctionnement qui étaient pratiquement ignorés jusqu’à très récemment. Bien qu’au cours des dernières années, plusieurs laboratoires se sont mis à la recherche de facteurs contrôlant le transport antérograde des RCPGs, les mécanismes qui régissent le repliement, la maturation et le transport des récepteurs du reticulum endoplasmique à la membrane plasmique sont encore imprécis.
L’objectif principal de cette thèse était donc d’augmenter notre compréhension des mécanismes permettant l’expression à la membrane plasmique des RCPGs. Pour ce faire, nous voulions d’abord identifier des nouveaux partenaires protéiques des récepteurs couplés aux protéines G impliqués dans la maturation et/ou le transport des récepteurs jusqu’à la surface. Nous avons donc effectué un crible protéomique utilisant la technologie de BRET (transfert d’énergie de résonance de bioluminescence), qui permet l’étude d’interactions protéines-protéines dans les cellules vivantes. Cela nous permettait de remplir un second objectif qui était le développement et la validation de l’essai de criblage protéomique de BRET pour l’identification de nouveaux partenaires des RCPGs. Nous avons mesuré le BRET entre le récepteur CCR5 fusionné à la luciferase et une librairie d’open reading frames (ORF) fusionnés à la protéine fluorescente jaune (YFP) qui codent pour des protéines non-caractérisées localisées dans la voie de sécrétion (RE, Golgi) [533]. Ces protéines étant localisées dans les compartiments cellulaires responsables de la synthèse et du transport des RCPGs, la probabilité d’identifier des partenaires protéiques des récepteurs impliqués dans leur repliement et/ou leur transport serait probablement très élevée. Le récepteur CCR5 a été choisi étant donné l’importance de sa localisation à la membrane plasmique dans le processus d’infection par le VIH.
Après avoir identifié des nouveaux partenaires protéiques potentiels des RCPGs localisés dans la voie de sécrétion, nous voulions ensuite évaluer la spécificité de ces
protéines envers les RCPGs, déterminer lesquelles jouent un rôle dans la maturation des récepteurs et si possible déterminer par quels mécanismes ou à quelle(s) étape(s) (repliement, dégradation, transport) elles influencent l’expression à la membrane plasmique des RCPGs.
Étant donné que la majorité des protéines impliquées dans les processus de repliement et de transport fonctionnent en complexes, nous voulions également déterminer si certaines des protéines identifiées pouvaient collaborer pour influencer le transport des RCPGs.
Afin d’améliorer la compréhension des mécanismes de régulation de la maturation des RCPGs, nous avons également contribué à une étude portant sur le role de la N- glycosylation dans la maturation et le transport de récepteurs V2 de la vasopressin mutants (annexe, article 3).
En plus de développer une nouvelle application de la technique de BRET pour le criblage d’interactions protéiques, nous avons également contribué à une étude visant le développement de nouvelles configurations de BRET constituées de protéines fluorescentes de différentes couleurs et permettant de mesurer plusieurs interactions indépendantes dans les mêmes cellules (annexe, article 4).