Famille de protéines cornichon

Les protéines cornichon appartiennent à une famille de protéines transmembranaires conservées de la levure aux mammifères qui semblent jouer un rôle important dans le transport intracellulaire. Je vais décrire dans cette section la découverte de ces protéines et les caractéristiques des différents membres de cette famille chez différents organismes. 3.2.1 Cornichon chez la drosophile

Le premier membre de la famille des protéines cornichons a été identifié chez la drosophile. Le nom cornichon provient du fait que la délétion du gène codant pour cette protéine résulte en la formation d’oocytes allongés ne possédant pas d’appendices dorsaux, un phénotype similaire (oocytes en forme de cornichon) à la délétion du gène gurken (grk), qui signifie cornichon en allemand [510]. Une étude plus poussée a révélée que les phénotypes des oocytes en formation produits par la délétion de cni sont tout à fait identiques à ceux produits par la délétion de grk, l’homologue de TGFα chez la drosophile, ou de torpedo (top), l’homologue du récepteur EGF de la drosophile [511]. Cette étude démontrait également que cni n’est pas requis pour la transription de grk et la stabilité, la localisation et la traduction de l’ARN de grk. Par contre, la protéine grk se retrouve davantage localisée dans le cytoplasme plutôt qu’à la membrane plasmique lorsque cni est absent ou muté suggérant que cette dernière pourrait influencer le transport de grk [511, 512]. Ensuite, il fut observé que grk colocalise avec dSec23p dans les sites de sortie du RE, alors que des allèles mutants de cni provoquent la diffusion de grk dans le RE et son exclusion des sites de sortie du RE [513]. Ces résultats suggèrent que cni permet de recruter

par les glycosyltransferases de l’appareil de Golgi nécessite cni confirmant que cette dernière est essentielle pour la sortie du RE de grk [514]. La fusion d’un domaine connu pour interagir avec les vésicules COPII sur grk permet de compenser partiellement la perte de cni et la fusion de la boucle intracellulaire de cni, qui serait responsable de l’interaction avec les protéines de COPII, à grk permet aussi de compenser pour la perte de cni [514]. Ces résultats suggèrent un modèle où cni agit comme récepteur-cargo de grk en recrutant ce dernier dans les vésicules COPII. Ensuite, la boucle luminale de cni peut lier directement la région adjacente du domaine transmembranaire de grk [514]. De plus, comme le domaine transmembranaire est nécessaire pour localisation de grk à la membrane plasmique et que plusieurs mutants à l’intérieur ou très près du TM de grk mènent à une localisation cytoplasmique de cette protéine, il a été suggéré que grk et cni interagissent aussi via leurs domaines transmembranaires [515].

Il existe chez la drosophile un deuxième gène similaire à cni qui se nomme cni-

related (cnir) [514]. Les deux protéines possèdent 28.5 % d’identité et 43.1 % de similarité

au niveau de leur séquence d’acides aminés et possèdent une structure similaire avec trois domaines transmembranaires, un domaine N-terminal cytoplasmique et un domaine C- terminal luminal. Cnir est incapable de lier grk et ne peut secourir le phénotype de signalisation déficiente de grk dans les oocytes contenant des mutants de cni [514]. Ces deux protéines ne possèdent donc pas des fonctions redondantes dans le transport de grk. De plus, contrairement aux mutants de grk, la perte de la fonction de cni cause également plusieurs phénotypes dans les tissus somatiques de la drosophile adulte suggérant que cni possède d’autres rôles que le transport de grk. La surexpression de cnir peut sauvegarder certains de ces phénotypes indiquant qu’il existe une redondance entre les deux protéines pour certaines fonctions cellulaires. Pour l’instant, aucun autre cargo de cornichon n’a été identifié chez la drosophile, mais des études effectuées chez la levure indiquent que cette famille de protéines pourrait favoriser l’export du RE de plusieurs substrats.

3.2.2 Cornichons chez la levure

La levure Saccharomyces cerevisiae possède deux homologues de cornichon nommés erv14p et erv15p (ER-vesicle proteins of 14 kD or 15 kD) qui ont d’abord été identifiés comme des composantes de vésicules COPII purifiées [516, 517]. Erv14p est localisé dans le RE, les vésicules COPII et l’appareil de Golgi [518]. La délétion d’erv14p

provoque la rétention dans le RE d’axl2p, une glycoprotéine transmembranaire, mais n’affecte pas le transport de gas1p, une protéine ancrée à la membrane par un groupement glycosylphosphatidylinositol (GPI), et de la protéine carboxypeptidase, suggérant qu’erv14p n’est pas nécessaire pour le transport de toutes les protéines employant la voie de sécrétion [518]. La délétion d’erv14p provoque un phénotype similaire à celle d’axl2p chez les cellules haploïdes, c’est-à-dire un défaut de la sélection du site de bourgeonnement. La délétion d’erv15p, qui partage 63 % d’identité d’acides aminés avec erv14p, ne reproduit pas ni n’accentue le phénotype de la délétion d’erv14p indiquant que ces deux protéines ne possèdent pas une fonction redondante sur le transport d’axl2p. De façon similaire à ce qui est observé chez la drosophile pour cornichon, erv14p interagit directement avec axl2p et forme un complexe avec les sous-unités des vésicules COPII (Sar1 et Sec23/24) permettant de favoriser l’incorporation d’axl2p dans ces vésicules [398]. Pour l’instant, on ne sait pas si erv14p interagit directement avec les sous-unités de COPII ou par l’intermédiaire d’une autre protéine. Un alignement de séquence de la boucle cytoplasmique de cornichon de différentes espèces révèle la présence de plusieurs résidus conservés et la mutation combinée de certains de ces résidus inhibe la liaison d’erv14p aux sous-unités de COPII [398]. De plus, la surexpression de ce mutant provoque la formation d’un complexe axl2p/erv14p retenu dans le RE. Le mécanisme d’action des protéines cornichons semble donc conservé entre les espèces.

La délétion d’erv14p provoque un défaut de sporulation chez les cellules diploïdes, un phénotype qui n’est pas relié à un défaut du transport d’axl2p, suggérant qu’erv14p pourrait favoriser le transport d’autres protéines. En effet, le défaut de sporulation est causé par la rétention dans le RE de la protéine Sma2p en absence d’erv14p [519]. Sma2p est une protéine possédant quatre domaines transmembranaires. Contrairement à ce qui était observé avec axl2p, la surexpression d’erv15p est capable de secourir le défaut de sporulation causé par l’absence d’erv14p et la délétion combinée de ces protéines accentue le phénotype. Enfin, une étude récente révèle que plusieurs protéines transmembranaires (gap1p, hxt1p, hxt2p et mid2p) sont retenues dans le RE en absence d’erv14p alors que d’autres protéines ne sont pas affectées [520]. Étonnament, gap1p possède dans sa région C-terminale un motif d’export di-acidique essentiel pour l’incorporation de gap1p dans les vésicules COPII [521]. La présence de ce motif n’est semble-t-il donc pas suffisant pour

son transport hors du RE et gap1p requiert également la présence d’une protéine adaptatrice telle que erv14p.

3.2.3 Cornichons chez les mammifères

Quatre membres de la famille des protéines cornichons ont été identifiés chez les mammifères. Chez l’homme, ces protéines sont nommées CNIH1, CNIH2, CNIH3 et CNIH4. CNIH1 partage 32 % d’identité avec erv14p et 66 % avec cni de la drosophile. Remarquablement, la surexpression de CNIH1 permet de secourir le défaut de bourgeonnement observé dans les souches de levures où erv14p est absent, suggérant que la fonction de ces protéines est conservée de la levure à l’homme [522]. CNIH1 est localisé dans le RE, aux sites de sortie du RE et dans l’appareil de Golgi. De plus, CNIH1 interagit avec la forme immature de TGFα dans les cellules de mammifères et la surexpression de CNIH1 retient TGFα dans le RE [522]. Par contre, CNIH1 n’interagit pas avec d’autres protéines transmembranaires de la voie de sécrétion telles que le récepteur de la transferrine, le récepteur EGF, sec61β et gp130 et n’affecte pas le transport à la membrane plasmique de gp130. Ceci indique une certaine sélectivité dans la fonction de transport de protéines transmembranaires par CNIH1. Le mRNA de CNIH1 est exprimé à un niveau élevé dans le cœur, le foie, les muscles squelettiques, le pancreas, les testicules, la glande thyroide, la rate et l’appendice alors qu’il est peu exprimé dans le cerveau, les reins, les poumons, les ovaires, l’estomac et le thymus indiquant que son expression est tissus spécifique [523].

CNIH2 et CNIH3 partagent 66 % et 68 % respectivement d’identité d’acides aminés avec CNIH1 et sont donc très similaires. La principale différence entre CNIH2/3 et CNIH est la présence d’une séquence de 15 acides aminés supplémentaires dans la boucle luminale entre le TM1 et le TM2 chez CNIH2/3 qui n’est pas présente chez CNIH1 ou CNIH4. Une étude de spectrométrie de masse dans le cerveau de rat a révélé que CNIH2 et CNIH3 font partis d’un complexe avec les récepteurs du glutamate de type AMPA (AMPAR), des canaux ioniques activés par le neurotransmetteur glutamate [524]. De plus, CNIH2/3 favorisent l’expression à la surface des AMPARs et accompagnent les récepteurs AMPA jusqu’à la membrane plasmique où ils modifient les propriétés d’ouverture du canal

en ralentissant leur cinétique de désensibilisation [524]. CNIH2 et CNIH3, contrairement à CNIH1, pourraient donc accompagner leur cargo jusqu’à la membrane plasmique. De plus, CNIH2 inhibe la resensibilisation des AMPARs par la sous-unité TARP ϒ-8 (protéines transmembranaires régulatrices des récepteurs AMPA). Cet effet n’est pas reproduit par CNIH1 indiquant que ces deux protéines ne sont pas redondantes dans le contrôle des récepteurs AMPA [525]. CNIH2 augmente l’efficacité d’un antagoniste non-compétitif des AMPAR indiquant qu’il pourrait affecter la pharmacologie du canal [526].

CNIH4, un des nouveaux partenaires des RCPGs identifié dans cette thèse, ne partage que 38 % d’identité avec CNIH1 et diffère donc davantage des trois autres cornichons. En fait, CNIH4 possède beaucoup plus d’homologie avec cni-related (51 % identiques, 82 % similaires), l’autre protéine cornichon chez la drosophile dont la fonction n’est pas caractérisée. Le premier article de cette thèse, qui démontre un rôle de CNIH4 dans le transport des RCPGs, représente la première caractérisation fonctionnelle de cette protéine. Comme les autres membres de la famille cornichon, cette protéine de 139 acides aminés possèdent 3 domaines transmembranaires potentiels ainsi que de très courtes régions N-teminale et C-terminale. Elle ne possède pas de domaine fonctionnel connu ni de sites consensus de modifications post-traductionnelles. L’ARNm de cette protéine est exprimé dans une grande variété de tissus incluant la moelle épinière, le cerveau, le cortex, le cœur, les muscles lisses et squelletiques, les reins, les poumons, le pancréas, la prostate la glande thyroïde, les ovaires et les testicules [527]. La région nécessaire pour l’interaction avec les vésicules COPII d’erv14p semble conservée chez CNIH4 suggérant un rôle possible de CNIH4 dans le recrutement de protéines dans ces vésicules de transport. Il est également possible que CNIH4 agisse de concert avec d’autres protéines pour influencer le transport intracellulaire. Dans le deuxième article de cette thèse, nous avons identifiés une protéine qui interagit avec les RCPGs et CNIH4 et coopère avec CNIH4 pour influencer le transport des RCPGs. Cette protéine se nomme protéine transmembranaire 9 (TMEM9). 3.3 Protéine transmembranaire 9

TMEM9 est une protéine transmembranaire récemment identifiée qui possède un peptide signal (résidus 1 à 20), une région N-terminale luminale glycosylée (résidus 21 à 89), un domaine transmembranaire (résidus 90 à 110) et une queue C-terminale cytoplasmique (résidus 111 à 183). La recherche de banques de données d’homologie de

séquence révèle la présence d’orthologues de TMEM9 chez plusieurs espèces dont la souris (mTMEM9, 95 % d’identité d’acides aminés), takifugu rubripes (trTMEM9, 76 % d’identité), Drosophila melanogaster (31 % d’identité) et Caenorhabditis elegans (28 % d’identité) [528]. La région C-terminale de ces protéines est particulièrement conservée suggérant que ce domaine joue un rôle important dans la fonction de TMEM9. La région C- terminale contient également un site potentiel de phosphorylation (S137). En plus des sites de glycosylations, on retrouve dans la région N-terminale trois domaines riches en cystéines conservés, qui pourraient jouer un rôle dans le repliement protéique, l’interaction avec d’autres protéines ou l’oligomérisation. La nature des sucres (simples ou matures) retrouvés sur TMEM9 n‘est pas connu pour l’instant. L’analyse de l’expression de l’ARNm de TMEM9 suggère que cette protéine est hautement exprimée dans la glande surrénale, la glande thyroide, les testicules, les ovaires, la prostate et à un moindre degré dans la colonne vertébrale (moëlle épinière), le gros et le petit intestin, la trachée, l’estomac, le thymus et la rate [528]. De plus, le mRNA de TMEM9 est surexprimé dans les cellules de carcinomes hépatiques [529]. La fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) à TMEM9 révèle qu’en plus d’être localisée dans le RE, TMEM9 est aussi présente dans les endosomes tardifs et les lysosomes [528]. La fonction de cette protéine était inconnue avant les travaux effectués dans cette thèse.

TMEM9 possède également un homologue nommé TMEM9B chez l’homme avec lequel il partage 57 % d’identité d’acides aminés. TMEM9B est essentiel pour la signalisation de NF-κB et la production de cytokines en réponse à divers signaux inflammatoires, mais le mécanisme par lequel il agit est inconnu [530].