Transcriptomique de la SpA : un autre moyen d’identifier des gènes impliqués dans

Même si elles apportent des informations décisives, les études génétiques sont loin de pouvoir expliquer la physiopathologie des maladies multifactorielles comme la SpA 221. Elles peuvent être très utilement complétées par des études fonctionnelles qui s’attachent à mesurer le niveau d’expression des gènes et à rechercher des gènes différentiellement exprimés entre patients et sujets témoins. De telles approches permettent :

- d’identifier des voies de signalisation auxquelles les gènes différentiellement exprimés appartiennent, facilitant ainsi la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie.

- de définir des bio-marqueurs de diagnostic précoce, de pronostic ou de réponse thérapeutique.

A ce jour, ces mesures d’expression génique, lorsqu’elles sont pangénomiques, se font le plus souvent à partir des transcrits (transcriptome), beaucoup plus rarement au niveau des métabolites (métabolome), et exceptionnellement au niveau des protéines (protéome). Pour le transcriptome, les puces d’expression offrent depuis quelques années une technologie éprouvée pour quantifier avec un coût raisonnable les transcrits, que ce soit dans les tissus cibles de la maladie ou dans le sang périphérique. Elles reposent sur l’hybridation des transcrits à mesurer, après synthèse de l’ADN complémentaire et marquage fluorescent, avec des sondes fixées sur la puce et représentatives de chacun des gènes (Figure 15).

Figure 15. Schéma résumant les étapes d’une étude d’expression globale à l’aide de puces.

Les ARNs totaux extraits sont retro-transcrits en ADN complémentaire (ADNc) double brin. Une transcription in vitro permet ensuite la synthèse d’ARN complémentaire (ARNc) simple brin étiqueté par de la biotine ou un fluorochrome. Il y alors fragmentation de l’ARNc, dépôt des fragments marqués sur la puce et hybridation des molécules marquées avec les sondes présentes sur la puce (les sondes sont des molécules d’ARN fixées immobilisées sur un support). Chaque spot est excité par un laser et l’intensité de la fluorescence émise est enregistrée. Il est ainsi possible de connaître le niveau d’expression de chaque gène de la cellule étudiée.

(D’après http://www.cfgbiotech.com/microarray/protocols)

Comme les GWAS, les études d’expression « génome entier » conduisent à effectuer de nombreux tests statistiques et imposent donc des précautions pour limiter le nombre de faux-positifs. Les gènes identifiés doivent être impérativement validés par qPCR (Figure 16) à l’aide des échantillons utilisés pour les puces dans les études diagnostiques et pronostiques comme dans les études physiopathologiques. Idéalement la validation des résultats doit également être faite dans une cohorte indépendante 222.

Figure 16. Schéma rassemblant les principales étapes de la PCR quantitative en temps réel (PCRq).

L’ARN total est rétro-transcrit en ADNc qui est ensuite amplifié par PCR. Cette technique mesure à chaque cycle la quantité d’amplicons synthétisés à l’aide de marqueurs fluorescents. (a) deux formats de fluorescence existent, le premier utilise une sonde interne fluorescente spécifique de la séquence nucléotidique du produit amplifié (sonde Taqman, par exemple), le second s’incorpore dans la double hélice d’ADN de façon non spécifique (le SYBR green). (b) plus l’échantillon est concentré en molécules cibles à l’origine, moins il

on utilise le Cq, qui est le nombre de cycles correspondant au début ou au point d’inflexion de la phase exponentielle de la courbe de croissance. Le bruit de fond défini par le Cq obtenu après PCR mais sans rétro-transcription est soustrait et les données sont normalisées en utilisant des gènes de ménage. Le plus souvent la quantité relative est calculée à l’aide d’un pool d’échantillons de références.

Lors du design d’une étude transcriptomique, plusieurs paramètres sont à prendre en considération. Tout d’abord, la taille de l’échantillon à rassembler afin d’avoir une puissance statistique nécessaire est à étudier. Ensuite, il est indispensable de s’attarder sur les critères de sélection des témoins et des patients (âge, sexe, antécédent familiaux, profil de malade, âge du début de la maladie et durée d’évolution, traitements reçus). Enfin, le type de puces d’expression et le nombre de gènes analysés sont à examiner.

Dans le cadre de la SpA, une dizaine d’études ayant pour objet d’identifier une signature transcriptomique de la maladie dans divers tissus ont été précédemment publiées et sont décrites ci-dessous (Tableau 7).

Auteurs Date Type de puce

Nombre de sondes / EST / transcrits Nombre de patients SpA (P) Nombre de témoins sains (T) Tissus / cellules étudié(e)s Nombre de gènes différentiellement exprimés entre P et T Critères de sélection (P et F)*

Gu et al. 2002 Atlas Human Array 7740–1 Nylon 588 transcrits 7 SpA et 6 PsA 7 PBMCs 4 entre SpA et T 4 entre PsA et T 3 entre SpA et PsA

p≤0,05

Rihl et al. 2004 Atlas Human 1.2

array Nylon Array 1185 EST 3 SpA 4

biopsies tissus synoviaux 18 F=1,5 et p≤0,05 Laukens et al. 2006

Type VII silane-

coated slides Array 74828 EST 15 SpA 10 biopsies colon 464

F≤ et ≥1,5 et p≤0,05 Rihl et al. 2008 Atlas Human 1.2

array Nylon Array 1185 EST 3 SpA 4

fluide articulation SI 47 F≤ et ≥2 Smith et al. 2008 Affymetrix U133 Plus 2.0 GeneChip 47000 transcrits 8 SA 9 macrophages dérivés de monocytes 141 F≤ et ≥1,25 et p≤0,01 Gu et al. 2009 Sentrix Human Ref-

8_v2 Beadchips 20000 sondes 46 USpA et 44 SA 46 PBMCs 4 entre SA et CT 38 entre USpA et CT F≤ et ≥2 Sharma et al. 2009 Affymetrix U133 Plus 2.0 GeneChip 47000

transcrits 18 SpA 25 sang total 107

F≤ et ≥1,5 et p≤0,05 Duan et al. 2010 Illumina HT-12 BeadChips 48000 transcrits 18 SA 18 PBMCs 452 p≤0,0005 Haroon et al. 2010 Affymetrix U133 Plus 2.0 GeneChip 47000

transcrits 16 SA - sang total 1428 p≤0,05 Assassi et

al. 2011

Illumina Human BeadChips

24000

sondes 16 SA 14 sang total 83 p≤0,01 Pimentel- Santos et al. 2011 Illumina HT-12 BeadChips 48000

transcrits 18 SA 18 sang total 221

F≤ et ≥1,5 et p≤0,05

Tableau 7. Principales études de puces à expression menées sur la SA ou la SpA.