TRANSCRIPTOME EN CELLULE UNIQUE DANS LA LEUCÉMIE MYÉLOÏDE CHRONIQUE (LMC) : L'ANALYSE DE PSEUDO-MOTIFS RÉVÈLE DES SIGNES

D'ÉTATS DE CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES ET TRANSITOIRES

L'une des principales raisons de l'impossibilité d'éradiquer la CSL la plus primitive dans la LMC est l'hétérogénéité de la maladie au moment du diagnostic ainsi que pendant les traitements de la TKI qui peuvent se succéder. Ce phénomène est certainement dû à l'instabilité génétique des cellules leucémiques exprimant le gène BCR-ABL, mais il a également été démontré que les CSL primitives ne sont pas dépendantes de l'activité TK du gène BCR-ABL. C'est pourquoi, au cours des dix dernières années, des recherches approfondies ont été menées pour identifier de nouvelles cibles impliquées dans l'auto-renouvellement des CSL, ce qui a permis d'identifier plusieurs cibles médicamenteuses importantes telles que SMO, ALOX5a, PML et STAT5. Toutefois, l'identification de ces voies, qui ont été validées dans des modèles précliniques et parfois déjà testées dans des essais cliniques, ne tient pas compte de l'hétérogénéité des cellules souches de la LMC au niveau d'une seule cellule. Les analyses du transcriptome unicellulaire et, plus récemment, de l'ARNseq unicellulaire permettent d'obtenir des informations sans précédent sur la physiopathologie des cellules cancéreuses.

Les études analysant l'hétérogénéité des cellules souches uniques de la LMC sont limitées et il n'existe actuellement aucune étude évaluant l'expression séquentielle des gènes à l'aide de l'analyse des pseudotimes.

Des données expérimentales récentes suggèrent que l'hétérogénéité des cellules souches de la LMC peut être due non seulement à leur expression différentielle BCR- ABL, mais aussi au développement d'événements moléculaires uniques générant des conséquences fonctionnelles en termes de potentiel des cellules souches. La compréhension de ces événements au moment du diagnostic de la maladie et pendant les thérapies par inhibiteurs de la tyrosine kinase (TKI) est d'un intérêt majeur car elle

peut expliquer l'évolution et la sélection clonale expliquant la résistance et la persistance de la LSC. Afin d'explorer ce phénomène, nous avons conçu une étude du transcriptome cellulaire unique utilisant la technologie Fluidigm permettant d'évaluer simultanément l'expression de 87 gènes. Des cellules CD34+ hautement purifiées provenant de 3 patients atteints de LMC au moment du diagnostic et de deux échantillons de sang de cordon ont été incluses dans l'étude. Des cellules individuelles de 70, 93, 93 provenant de trois patients ont été immobilisées dans des puces microfluidiques et l'expression de 87 gènes a été évaluée dans chaque cellule. Après normalisation indépendante et filtration préalable, une matrice fusionnée a été construite avec 256 cellules valides et 87 transcrits.

Dans ce travail, notre premier objectif était de déterminer, au niveau de la cellule unique, le profil de l'expression des gènes dans les cellules leucémiques uniques en utilisant un panel de gènes impliqués dans la physiopathologie de la LMC. Nous avons choisi à cette fin, les gènes impliqués dans l'auto-renouvellement de la quiescence de la LSC, la résistance aux médicaments et l'apoptose. Comme certaines données antérieures faisaient état de l'implication potentielle de gènes de pluripotence dans l'évolution de la LMC, nous avons inclus dans notre analyse des gènes tels que OCT4, SOX2, KLF4 et NANOG. La technologie Fluidigm à cellule unique a été utilisée pour analyser l'expression simultanée de ces gènes. Pour la première fois à notre connaissance, nous avons analysé ces cellules en utilisant l'outil bioinformatique Pseudotime permettant de classer les gènes dans une trajectoire, en fonction des niveaux d'expression dans la population analysée. La technologie Pseudotime est un outil bioinformatique unique qui permet d'analyser les modèles d'expression des gènes dans les cellules individuelles dans lesquelles un transcriptome a été effectué. L'un des principaux avantages de cette méthodologie est d'utiliser l'algorithme Monocle qui permet d'obtenir des informations sans précédent sur la dynamique du transcriptome à partir de données recueillies à différents moments de la séquence. La question de l'hétérogénéité de la CSL LMC a été récemment étudiée, permettant d'identifier, dans une analyse combinée des mutations et du transcriptome, la présence de multiples sous-clones évoluant au cours de la thérapie. À notre connaissance, il n'existe pas

d'étude évaluant le rôle de l'expression séquentielle des gènes dans une seule cellule à l'aide d'un panel dont nous rendons compte ici.

Cette analyse a permis d'identifier un groupe de 13 gènes fortement connectés et enrichis en gènes de pluripotence tels que NANOG, POU5F1, LIN28A, SOX2 ; une population de type "cellules souches" représente 8,59% des cellules analysées. L'analyse bioinformatique avec matrice corrigée et algorithme tSNE a permis d'identifier quatre groupes distincts et l'analyse pseudo time a confirmé dans les 4 groupes identifiés, la présence de 7 états cellulaires séparées par 3 branches d'intersection reliant l'expression d'ALOX5 a été associée au groupe de cellules exprimant les marqueurs de pluripotence. Dans les analyses in vitro, deux gènes dont on avait prédit qu'ils allaient subir une régulation similaire par l'analyse des pseudos (ALOX5 et FGFR) se sont révélés être inhibés de manière similaire par le Ponatinib, un inhibiteur du FGFR. Enfin, en utilisant une cohorte indépendante de patients atteints de LMC, nous montrons que l'expression des gènes de la pluripotence est une caractéristique commune des cellules CD34+ de la LMC au moment du diagnostic. Dans l'ensemble, ces expériences ont permis d'identifier des cellules souches individuelles exprimant des niveaux élevés de gènes de pluripotence au moment du diagnostic, dans lesquelles un continuum d'états transitoires a été identifié à l'aide d'une analyse de pseudo-caractères. Ces résultats suggèrent que la persistance des CSL dans la LMC est régulée par des états transitoires des cellules souches qui doivent être ciblées simultanément plutôt que d'utiliser une seule chemin.

Experimental Hematology 2020;000:1−10

REGULAR SUBMISSION

Single-Cell Transcriptome in Chronic Myeloid Leukemia: Pseudotime