LA KINASE DU FACTEUR D'ÉLONGATION EUCARYOTE 2 (EEF2K) EST UNE CIBLE TRANSCRIPTIONNELLE DE BCR-ABL ET EST IMPLIQUÉE DANS LA

SURVIE DES CELLULES LEUCÉMIQUES

Dans des études précédentes, nous avons démontré une augmentation importante de l'expression de l'ARNm ETS1 dans les cellules UT7 exprimant la BCR-ABL par rapport aux cellules témoins UT7. Comme EEF2K a été identifié comme une cible transcriptionnelle du gène ETS1 dans les cellules exprimant BCR-ABL, nous avons vérifié l'expression du gène EEF2K dans le sang périphérique (sang total) des patients atteints de LMC au moment du diagnostic (n = 59) par rapport aux donneurs de santé (n = 32). Nos résultats ont montré une augmentation majeure de l'expression du gène EEF2K chez les patients atteints de LMC par rapport aux témoins, avec une valeur p < 2,2e-16.

Pour déterminer le type de cellules dans lesquelles EEF2K est surexprimé, nous avons testé son expression dans les cellules CD34+, CD34- et PBMC purifiées de 3 patients atteints de LMC. Nos analyses ont révélé une expression plus élevée d'EEF2K dans des cellules plus différenciées, de densité lumineuse et des cellules CD34-, par rapport aux cellules CD34+, ce qui suggère que l'expression d'EEF2K semble être accrue dans les cellules engagées dans la différenciation. Ce résultat a été confirmé par l'analyse d'une seule cellule de cellules CD34+ isolées du sang périphérique de patients atteints de LMC, montrant que l'expression de EEF2K était significativement plus faible (p = 0,006978) dans les cellules apparentées aux cellules souches.

Les analyses par Western blot dans les cellules UT7 exprimant le BCR-ABL ont permis de détecter des niveaux plus élevés d'EEF2K et de l'expression de la protéine EF2 qui lui sert de cible, par rapport à l'UT7 parentale. Considérant que l'expression d'EEF2K peut être directement régulée par la présence ou la rareté des nutriments dans les cellules cancéreuses, nous avons analysé l'impact d'une privation de nutriments sur l'expression d'EEF2K dans le contexte de BCR-ABL. Pour réaliser des expériences de

privation de nutriments, les cellules ont été cultivées pendant 4 jours dans trois conditions différentes : conditions normales (NC), pas de condition FBS (NF) et pas de condition glucose (NG) .

Les résultats suggèrent que, comme le montrent d'autres systèmes de culture cellulaire, l'expression de EEF2K dans des conditions de culture normales oscille en fonction des niveaux de nutriments afin de stopper l'élongation, ce qui permet de protéger les cellules contre l'excès de protéines intracellulaires inutiles. Cependant, dans les cellules exprimant le gène BCR-ABL, l'expression de EEF2K ne semble pas être régulée en fonction des niveaux de nutriments, ce qui suggère que le gène EEF2K est régulé différemment dans les cellules BCR-ABL positives et négatives.

Pour évaluer plus avant les effets potentiels de l'expression de EEF2K dans le contexte de l'expression de BCR-ABL, nous avons conçu des expériences de knockdown en utilisant la stratégie de l'ARNsh. À cette fin, deux ARNsh différents ciblant EEF2K en présence d'un contrôle de brouillage ont été utilisés.

Dans des conditions normales, les taux de prolifération des cellules UT7 shEEF2K ont été significativement réduits par rapport aux contrôles de brouillage alors que dans les mêmes conditions, les cellules UT7 -11-shEEF2K ont proliféré. Dans des conditions de privation de nutriments - sans glucose et/ou FBS - les taux de prolifération des cellules UT7 et UT7 p210 ont tous deux diminué. Cependant, dans les cellules UT7- 11-shEEFK2, une reprise de la prolifération par rapport aux témoins de brouillage suggère que l'invalidation EEF2K dans les cellules positives BCR-ABL permet une prolifération normale malgré la privation de nutriments. EEF2K semble avoir protégé les cellules UT7-11 de l'effet de la privation de nutriments (FBS et glucose) alors que cela ne s'est pas produit dans les cellules UT7 dans lesquelles on a remarqué un effet inverse, à savoir une augmentation des indices décroissants de prolifération dans les cultures sans FBS. L'inhibition de l'EEF2K dans les cellules UT7 n'a pas eu d'impact sur les taux de prolifération en cas de privation de glucose, par rapport au brouillage. En outre, l'inhibition d'EEF2K n'a eu aucun effet sur la réponse de l'imatinib in vitro, ni dans des conditions normales ni dans des conditions de privation de nutriments, par rapport à la culture brouillée.

Energy Phenotype de la technologie SeaHorse UT7 et les niveaux ECAR dans les cellules UT7 ont été influencés par shEEF2K dans les cellules UT7 par rapport aux témoins scrables, les cellules ne répondant pas aux conditions de stress. D'autre part, les cellules UT7-11 ont augmenté les niveaux d'ECAR avec ou sans invalidation par EEF2K, ce qui suggère l'absence de contrôle exercé par la voie EEF2K dans les cellules transformées par BCR-ABL.

Le transcriptome de la lignée cellulaire UT7 basale comparant l'ARNsh EEF2K et son ARNsh brouillé a permis d'identifier 402 gènes différentiels exprimés, révélant une induction positive de la migration des granulocytes et une voie sécrétée régulée. Ces résultats ont montré que EEF2K joue un rôle répressif important dans le processus invasif régulé par la cellule myéloïde au niveau basal.

Dans le contexte de la lignée cellulaire UT7-11, l'ARNsh EEF2K a induit des gènes exprimés de manière moins différentielle : seuls 136 gènes ont été trouvés régulés, avec 76 gènes régulés vers le haut et 60 gènes régulés vers le bas. Cette analyse a également révélé une augmentation de la régulation positive dans l'apoptose intrinsèque. Une régulation positive des gènes cibles E2Fs a également été trouvée significative dans les lignées cellulaires UT7 p210 BCR-ABL sous l'action de l'ARNm EEF2K. Des signatures réprimées par l'ARNsh EEF2K dans des conditions basales et p210 BCR-ABL ont été trouvées de manière quantitativement similaire avec respectivement 64 et 60 gènes régulés à la baisse.

IN PREPARATION

EUKARYOTIC ELONGATION FACTOR 2 KINASE (eEF2K) IS A TRANSCRIPTIONAL TARGET OF BCR-ABL AND IS IMPLICATED IN THE