Après cette série d’analyses, la configuration D-DBD est privilégiée à la configuration S-DBD pour les applications potentielles du dispositif en raison du risque de formation d’un arc électrique en S-DBD. Le dispositif D-DBD a été utilisé pour le traitement des sphéroïdes HCT 116 avec les paramètres suivantes :
— Débit d’argon de 3 l/min ;
— Tension inter-électrodes de 10 kV ;
— Durée des impulsions de tension de 1 µs ; — Fréquence de répétition de 9.69 kHz ; — Distance de traitement in vitro de 3 cm.
Ces paramètres correspondent à ceux utilisés lors des traitements indirects in vitro de tu-meurs avec le dispositif DBD hélium (voir chapitre 6). Les résultats obtenus précédemment avec le dispositif DBD hélium constituerons donc une base de comparaison pour évaluer l’efficacité du jet d’argon.
Nous avons donc effectué des traitements indirects in vitro de tumeurs du colon HCT116 avec le dispositif D-DBD argon dans les mêmes conditions que lors des traitements avec le dispositif DBD hélium hormis la distance de traitement qui est plus importante dans le cas du jet D-DBD argon (3 cm contre 2 cm) ce qui devrait pénaliser ce dernier en terme d’efficacité car les concentrations d’espèces actives et l’irradiance UV-C sont plus faibles à 3 cm de la sortie du tube en quartz qu’à 2 cm.
Dans un premier temps, nous avons comparé le nombre de cellules positives aux dommages à l’ADN 4 h après le transfert des micro tumeurs dans le milieu activé par plasma3. Comme l’indique le tableau 8.7, le taux de dommages à l’ADN pour un traitement par jet de plasma DBD argon est de l’ordre de 51.94 % pour une durée d’activation du liquide de 120 s. Pour une même durée d’activation du liquide avec le plasma DBD hélium, le taux de cellules positives aux dommages à l’ADN était significativement inférieur (29.96 %). On remarque qu’il faut une durée d’activation du liquide avec le jet DBD hélium deux fois plus longue (240 s contre 120 s) qu’avec le jet D-DBD argon pour produire la même proportion de cellules dont l’ADN est endommagé.
Table 8.7 – Proportion de cellules positives aux dommages à l’ADN 4h après activation du liquide avec les dispositifs plasma utilisés (Les tumeurs ont été immergées dans le liquide 15 min après l’activation plasma de ce dernier). Conditions expérimentales : Amplitude des impulsions de tension de 10 kV, durée d’une impulsion de 1 µs, fréquence de répétition de 9.69 kHz, flux d’argon de 3 l/min, distance de traitement de 2 cm pour le jet DBD hélium et 3 cm pour le jet D-DBD argon.
DBD hélium DBD hélium D-DBD argon Durée d’activation du liquide (s) 120 240 120 Cellules avec dommage à l’ADN (%) 29.96 ± 5.08 49.50 ± 4.69 51.94 ± 4.81
Dans un second temps nous avons cherché a étudier la réaction à long terme des micro tumeurs après traitements. Pour cela, le volume des micro tumeurs a été mesuré quotidien-nement pendant les neuf jours suivants le traitement puis normalisé par rapport au volume des sphéroïdes non traités (voir figure 8.6.1). Comme pour le taux de cellules positives aux dommages à l’ADN, la courbe des volumes normalisés pour une durée d’activation du liquide de 120 s avec jet de plasma D-DBD argon est sensiblement identique à celle obtenue après une durée d’activation de liquide de 240 s avec le jet DBD hélium.
L’inhibition de croissance ayant la même allure avec les deux dispositifs plasma, nous faisons l’hypothèse que les mécanismes d’altération des micro-tumeurs sont identiques. Il est par conséquent très probable que la concentration en peroxyde d’hydrogène dans le liquide activé par plasma soit plus importante pour une activation du liquide avec le jet D-DBD argon qu’avec le jet DBD hélium. Pour confirmer cette hypothèse, les analyses chimiques effectuées sur le jet de plasma DBD hélium devront également être réalisées sur le jet de plasma DBD argon.
Figure 8.6.1 – Croissance relative des sphéroïdes après activation plasma du PAM avec le jet de plasma DBD hélium et le jet de plasma D-DBD argon (Texp =120 s et 240 s, Ttrans = 15 min, Tstockage = +37 °C). Les sphéroïdes sont traités à J=0 et observés pendant les 9 jours suivants. Les données sont exprimées comme la moyenne ± écart-type évalués à partir de 4 expériences indépendantes.
Mes travaux de recherche ont été consacrés à la compréhension mécanistique des traite-ments par plasma froid de cellules cancéreuses colorectales. Plus précisément, cette thèse s’est intéressée à l’activation de liquide par exposition aux jets de plasma froid DBD pour le traitement de tumeurs HCT 116 du cancer colorectal.
Les expérimentations décrites dans ce mémoire ont montré le potentiel génotoxique et citotoxique des traitements indirects par plasma froid à travers un retard de croissance tumorale. Ce retard de croissance est constituée de deux phases distinctes. La première consiste en un détachement des cellules périphériques de la micro tumeur qui intervient seulement quelques heures après le transfert des micro tumeurs dans les liquides activés par plasma. La seconde phase est une vitesse de prolifération réduite conduisant à un retard de croissance constant pendant au moins 9 jours des micro tumeurs suite à un traitement indirect par jet de plasma froid.
Le détachement des cellules périphériques est induit par la formation du radical hydroxyle à l’intérieur des cellules à partir du peroxyde d’hydrogène contenu dans le liquide activé par plasma. La réaction de Fenton permettant le relargage du radical hydroxyle dans le milieu intracellulaire conduit probablement à des réactions entre le radical et le contenu intracellu-laire et plus particulièrement l’ADN. Les dommages à l’ADN ainsi générés peuvent dépasser la capacité des cellules à se réparer déclenchant alors une mort par apoptose des cellules et un détachement cellulaire du reste de la tumeur. Ce taux de dommages à l’ADN peut accroître si on augmente le temps d’exposition du liquide au jet de plasma. Il est important de souligner que le stockage du PAM à une température idéale pour la conservation du peroxyde d’hydrogène dans le liquide permet de préserver ses propriétés génotoxiques.
La vitesse de prolifération réduite suite au traitement a été identifiée comme imputable à des espèces générées dans le liquide suite à l’exposition au plasma. En effet, lorsque le liquide activé par plasma est changé par du milieu non exposé après le traitement il a été observé une reprise de croissance importante. L’activation avec le jet de plasma génére un nombre important de radicaux dans les liquides qui vont réagir avec les composants du liquides et plus particulièrement tous les éléments essentiels à la croissance cellulaire comme les acides aminés et les facteurs de croissances. Ces réactions vont modifier les éléments indispensables à la croissance cellulaire et donc induire à long terme une vitesse de prolifération réduite. De plus, lors de l’activation du liquide, le jet va induire la formation de nitrites et nitrates ayant
un rôle dépendant de leur concentration. En effet, il a été démontré que, pour de faibles concentrations, les nitrites et nitrates ont un effet pro-prolifératif alors qu’une concentration élevée de ces derniers est au contraire anti-proliférative.
Il a également été démontré que les jets de plasma présentent une sélectivité lors du traitement du cancer avec une attaque préférentiellement ciblée sur les cellules cancéreuses et non sur les cellules saines. Cette observation a été faite lors du traitement de micro tumeurs réalisées à partir de cellules de fibroblastes. L’hypothèse quant à cette sélectivité serait liée un niveau de peroxyde d’hydrogène plus élevé dans les cellules cancéreuses que dans les cellules saines combiné à des moyens de défenses limités. Pour valider les hypothèses concernant la sélectivité du plasma, il serait judicieux d’étudier les sensibilités au peroxyde d’hydrogène de plusieurs lignées cellulaires cancéreuses et saines.
En modulant le temps de contact entre les liquides activés par plasma et les micro tumeurs nous avons pu étudier les effets du temps de contact court entre le PAM et les sphéroïdes. Dans ces expérimentations nous avons mis en contact les micro tumeurs et les liquides activés par plasma seulement 10 minutes pour recréer la diffusion dans le corps suite à l’injection de liquides activés dans une tumeur. Contrairement au temps de contact dit long aucun détachement cellulaire n’est observé lors de ces expériences. La réponse des micro tumeurs se compose d’une première phase pendant laquelle la vitesse de prolifération des cellules est réduite pour réparer les dommages à l’ADN induits par le peroxyde d’hydrogène lors du traitement. Suite aux réparations, une reprise de croissance est observée 6 jours après traitement conduisant à une diminution de l’efficacité du traitement à long terme. La différence de comportement lors des traitements étant imposée par le nombre de dommages à l’ADN observés. Dans le cas de contact court entre les micro tumeurs et les liquides activés par plasma, les dommages à l’ADN sont relativement peu importants et peuvent donc être réparés. De plus, lorsque la phase de réparation est terminée les micros tumeurs se situent dans un milieu de culture contenant tous les facteurs de croissance nécessaires à une reprise de croissance importante.
À partir de l’ensemble de ces observations nous avons réalisé une série de manipulations sur le traitement de cellules cancéreuses du cancer colorectal sur modèle murin in vivo (dont le protocole est entièrement décrit dans la section 3.2.3 de ce mémoire). Le suivit de volume est effectué pendant 20 jours le volume de tumeurs (voir figure 8.0.1) répartis en 3 groupes : une série de souris avec des tumeurs non traitées, un groupe de souris avec tumeurs traité avec 50 µL de milieu de culture DMEM non activé par plasma (injecté 3 fois par semaine) et un dernier groupe de souris avec tumeurs est traité à la même fréquence que le deuxième groupe avec 50 µL de milieu de culture exposé 120s au plasma. Alors qu’aucune distinction entre les groupes n’est observée pendant les 13 premiers jours, on observe un détachement de la courbe des tumeurs traitées par le PAM. Ainsi au bout de 20 jours, les tumeurs traitées de manière indirecte par plasma présentent un volume inférieur de 242 mm3 aux volumes des micro tumeurs non traitées par PAM (contôle et tumeurs traitées par injection de milieu nutritif non exposé au plasma). Ces résultats correspondent à une inhibition de croissance
par plasma froid DBD hélium.,,tumeurs non traitées ; , injection de 50µL de milieu DMEM non exposé au plasma 3 fois par semaine ; a, injection de 50µL de milieu DMEM exposé 120s au jet de plasma DBD hélium 3 fois par semaine.
20 jours après le début du traitement de 69%. Cette expérience montre effectivement les capacités du traitement indirect par plasma pour le traitement in vivo du cancer colorectal. Elle montre également que l’efficacité du traitement est liée à l’injection répétée du liquide activé par plasma avec un effet identifiable à long terme.
Les perspectives d’études in vivo concerne principalement le volume du liquide activé injecté lors du traitement et le temps d’exposition du liquide au jet de plasma. Concernant les études in vitro sur micro tumeurs ils est envisageable de diminuer le temps de contact entre les liquides activés par plasma et les micro tumeurs pour essayer de retrouver le comportement observé in vivo.
Le second objectif durant ces travaux de thèse a été de développer un dispositif plasma au sein du groupe PRHE. Après de nombreuses caractérisations physique du plasma, nous avons démontré que le dispositif plasma DBD argon était tout à fait adapté à des applica-tions biomédicales. L’ajout d’une seconde barrière diélectrique dans ce dispositif ne modifie que très peu les propriétés du plasma tout en permettant une application directe lors d’ex-périmentations in vivo en évitant la formation d’arcs électriques. Des essais préliminaires sur des micro tumeurs du cancer colorectal ont montré une plus grande efficacité de ce dis-positif plasma DBD argon vis à vis du jet DBD hélium utilisé dans le groupe de recherche pour les applications biomédicales. Par conséquent, ce nouveau dispositif DBD argon doit être étudié plus en détail sur modèle in vitro et in vivo pour mieux appréhender les
nou-velles capacités de ce dispositif. Dans les perspectives, il serait important d’analyser et de quantifier les différentes espèces radicalaires et non radicalaires produites dans le liquide suite à l’activation de liquides par le jet de plasma d’argon. Il faudrait également évaluer la production de peroxyde d’hydrogène dans les liquides activés par le jet DBD argon. Il est également envisageable de doser la production d’espèces oxydatives en phase gazeuse par le plasma au travers de techniques comme la LIF (Laser Induced Fluorescence) et de la comparer à l’efficacité biologique des différents jets disponibles au laboratoire LAPLACE.
En conclusion, les éléments apportés par ces travaux montrent que le traitement indirect par liquides activés par plasma est une solution prometteuse en tant qu’agent antitumoral et plus particulièrement dans le traitement du cancer colorectal. Le traitement indirect par plasma se décompose en plusieurs modes d’actions qu’il est possible d’optimiser en adaptant le protocole de traitement, le stockage des liquides activés par plasma, le dispositif plasma utilisé ainsi que alimentation électrique. Cette nouvelle stratégie thérapeutique a montré des résultats in vivo encourageants ainsi qu’une sélectivité lors des phases d’expérimentation. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre le principe de sélecti-vité, particuliérement en mesurant la sensibilité de différentes lignées cellulaires cancéreuses et saines ainsi que leurs moyens de protection contre le stress oxydatif.
Influence de la présence de sérum de
veau dans le milieu activé par plasma sur
Figure A.0.1 – Influence du sérum de veau dans le milieu activé par plasma sur les dom-mages à l’ADN. Temps d’exposition de 120s et stockage à +37°C. Pas de variations significatives du taux de dommage à l’ADN en présence de sérum.
Protocole de quantification de
l’adenosine triphosphate dans le
sphéroïde et le surnageant
Figure B.0.1 – Protocole de quantification de l’adenosine triphosphate dans le sphéroïde et le surnageant.
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