Le PAM peut être considéré comme étant une sources d’espèces réactives grâce à la formation d’espèces radicalaires et non-radicalaires après son activation par jet de plasma. La présence de ces espèces dans le PAM peut expliquer les effets génotoxique et cytotoxique observés lors du traitement indirect des sphéroïdes HCT116 (cf. chapitre 6). En effet, lors d’une exposition au jet de plasma, il y a formation d’espèces réactives stables, tels que le peroxyde d’hydrogène et les nitrites / nitrates qui peuvent pénétrer dans les cellules et
être des précurseurs potentiels d’espèces réactives intracellulaires. Un schéma récapitulant l’ensemble des espèces observées et caractérisées dans ce chapitre ainsi que leurs effets sur les cellules cancéreuses est représenté dans la figure 7.7.1.
Figure 7.7.1 – Bilan des espèces générées dans un milieu de culture après exposition au jet de plasma DBD hélium et les réactions conduisant à des effets sur les cellules cancéreuses.
On distingue trois mécanismes d’interaction :
Le peroxyde d’hydrogène qui est capable de générer des dommages à l’ADN. Ces dom-mages peuvent être très probablement attribués à la réaction dans le milieu intracellulaire du fer avec le peroxyde d’hydrogène via une réaction de Fenton [229]. Cette réaction génère des radicaux hydroxyle qui peuvent directement induire des dommages à l’ADN.
La deuxième voie d’interaction est la modification des acides aminés et protéines. En effet, une modification et une déplétion en facteurs de croissance dans le milieu de culture peut entrainer un ralentissement voir un arrêt de prolifération cellulaire qui concorde avec les résultats à long terme observés lors du traitement in vitro des sphéroïdes HCT116.
Enfin, le dernier mode d’action des plasmas froids regroupe les nitrates et nitrites qui peuvent être recyclés dans le milieu intracellulaire en oxyde nitrique. Dans ces conditions, il a été montré que suivant la concentration en oxyde nitrique et en fonction du type cellulaire, ces espèces peuvent avoir un effet pro-prolifératif ou anti-prolifératif.
7.8 Conclusion
Nous avons mis en évidence et caractérisé la formation de certaines espèces radicalaires comme le radical hydroxyle, l’anion superoxyde, l’oxygène singulet et l’oxyde nitrique ainsi que des espèces non-radicalaires comme le peroxyde d’hydrogène et les nitrites/nitrates suite à l’exposition de différents liquides au jet de plasma froid fonctionnant à l’hélium.
Ces espèces peuvent provenir directement de la solvatation des molécules présentes dans le plasma ou d’une interaction de ces radicaux en milieu aqueux.
Dans un milieu complexe comme le DMEM, contenant de nombreuses biomolécules comme des protéines et des acides aminés, la concentration en radicaux diminue très fortement et s’accompagne d’une détection importante du radical hydrogène. L’hypothèse avancée est une réaction entre les biomolécules et les radicaux libres entrainant leur modification et le relargage de radical hydrogène dans le milieu [210, 227]. La diminution de signal observée est alors issue du quenching des radicaux par les biomolécules qui est privilégié par rapport au piégeur.
Enfin en présence de sérum (SVF) dans le milieu de culture, la concentration des espèces radicalaires diminue souvent drastiquement. Cela peut être attribué à un effet de quenching plus important de part la présence de nombreuses autres biomolécules dans le sérum ainsi qu’à la présence d’albumine connue pour ses propriétés antioxydantes et de piégeur de radicaux libres [228].
Concernant les espèces à longue durée de vie, on observe que la concentration en peroxyde d’hydrogène est indépendante du milieu de culture. Ces résultats sont en totale accord avec les mesures réalisées in vitro sur sphéroïdes. Lors de ces mesures, la présence ou non de sérum de veau fœtal dans le milieu ne modifié en rien la réponse des sphéroïdes aux traitements par plasma le premier jours particulièrement en ce qui concerne les dommages à l’ADN (voir annexe A).
Les nitrites et les nitrates sont quant à eux dépendant du milieu de culture mais leur concentration augmente avec la complexité du milieu exposé au plasma. En tout état de cause, cette dépendance indique que les nitrites et nitrates produits suite au traitement ne réagissent pas avec les biomolécules des milieux et donc vont être plus ou moins stable dans le temps.
jet de plasma DBD Argon
« Un nihiliste, c’est un homme qui ne s’incline devant aucune autorité, qui ne fait d’aucun principe un article de foi, quel que soit le respect dont ce principe est auréolé. »
Conception d’un jet de plasma d’argon
Aux début de mes travaux de thèse, deux types de jets étaient utilisés dans le groupe de recherche PRHE pour des applications biomédicales dans l’air ambiant : un jet de plasma DBD fonctionnant avec de l’hélium et un jet Surfatron fonctionnant avec de l’argon. Nous venons de présenter un traitement indirect de cellules cancéreuses du colon in vitro impli-quant le jet de plasma DBD fonctionnant avec de l’hélium. Ce jet a également été utilisé en application directe sur les mêmes cellules par Joseph Marie Plewa [132]. Le jet Surfatron a quant à lui m’a permis d’obtenir des informations préliminaires indispensables sur les méthodes d’analyses biologiques et son efficacité bactéricide a été évaluée sur des bactéries à l’état planctonique [10]. Ce travail a mis en évidence l’importance des radiations UV-C émises par les jets de plasma fonctionnant avec de l’argon. Dans nos conditions expérimen-tales, il a été observé que l’effet bactéricide de ce jet était principalement dû à ces radiations UV-C et dans une moindre mesure, à la présence peroxyde d’hydrogène dans le milieu.Toutefois, le jet Surfatron n’est pas adapté pour le traitement de tumeurs en raison de son dispositif de refroidissement. En effet, il y a un risque de brûlure par le plasma (800 K) en cas de défaut de refroidissement de ce dispositif et la nécessité d’utiliser deux gaz (argon et air comprimé) est contraignante. Le jet DBD d’hélium n’est pas idéal non plus car, bien que la température apparente du jet soit compatible avec une application sur le vivant, l’hélium est un gaz non renouvelable et beaucoup plus onéreux que l’argon. De plus, les établissements médicaux sont, pour la plupart, déjà équipés d’un réseau de distribution d’argon. Enfin, l’analyse spectroscopique révèle la formation de plus d’espèces chimiques dans les jets plasma froids d’argon que d’hélium. C’est pourquoi un volet de cette thèse a été dédié à la conception d’un dispositif générant un jet de plasma froid DBD d’argon soufflé dans l’air ambiant, cette configuration permettant, apriori, de produire une quantité importante d’espèces actives à une température proche de la température ambiante. La solution la plus évidente aurait été d’utiliser le même dispositif DBD existant en remplaçant la bouteille d’hélium par une bouteille d’argon. Néanmoins, le champ disruptif de l’argon étant plus élevé que celui de l’hélium, ce choix aurait nécessité d’accroître la tension délivrée par le générateur au-delà des limites de ce dernier. Plutôt que d’investir dans un nouveau
générateur de haute tension, nous avons utilisé une autre géométrie d’électrode permettant de générer un champ électrique plus important sans changer de générateur de tension. L’architecture de ce générateur de jet plasma sera présentée dans la suite de ce chapitre. La caractérisation électrique et optique du jet sera ensuite présentée. Cette étape permettra de comparer les différents jets utilisés dans le cadre de cette thèse. Pour finir, une application directe in vitro de ce jet sur des tumeurs du colon sera présentée.
L’ensemble des analyses présentées dans cette partie a été publiée dans deux articles [230, 231].
8.1 Configuration du générateur jet de plasma DBD
d’argon
Le nouveau dispositif générant un jet de plasma d’argon a été conçu autour d’une configu-ration DBD dite « cylindre-cylindre » différente de celle utilisée pour l’hélium. La fig. 8.1.1 représente une photographie du jet de plasma en fonctionnement. Plus précisément, il s’agit d’une électrode externe en aluminium (2) enroulée autour de la face externe d’un tube de quartz (1) et d’une électrode haute tension (3) à l’intérieur du tube constituée par une tige de cuivre (voir la figure 8.1.1). L’électrode interne est reliée au générateur de haute ten-sion pulsée tandis que l’électrode externe est reliée à la masse de ce dernier. Pour limiter le risque d’apparition d’un arc électrique, il est préférable d’isoler l’électrode interne dans un second tube en quartz (4) dont une extrémité est fermée. L’argon est injecté avec un débit de quelques litres/min dans le tube en quartz à travers un débitmètre (Brooks). Le générateur de tension délivre les impulsion de haute tension avec une fréquence et une durée d’impulsion variables (respectivement de 1 Hz à 10 kHz et de 125 ns à 100µs). L’ensemble du dispositif à l’exception du générateur de tension est encastré dans un bloc cylindrique en plexiglas de 54 mm de diamètre faisant office de poignée. L’épaisseur de ce bloc a été calculée afin de garantir une distance suffisante entre l’électrode interne et l’utilisateur.
Pour plus de détails, les caractéristiques des principaux composants du dispositif sont résumées dans le tableau suivant :
Composant Caractéristiques n°
Tube externe en quartz, ext = 8 mm , épaisseur : 1 mm, longueur 37 mm 1 Électrode externe feuille d’aluminium largeur 17 mm, épaisseur : 1 mm 2 Électrode interne tige de cuivre = 2 mm, longueur : 71 mm 3 Tube interne en quartz, ext = 4 mm , épaisseur : 1 mm, longueur 50 mm 4 Générateur Impulsion de tension 0-10 kV, 1 µs, 100Hz-9.69 kHz 5 Table 8.1 – Caractéristiques des principaux composants du générateur DBD de jet de
Figure 8.1.1 – (a) Représentation schématique en coupe du générateur DBD de jet de plasma froid développé pour fonctionner avec de l’argon. La numérotation fait référence au tab. 8.1 (b) photographie du dispositif générant un jet de plasma en fonctionnement