Radical hydroxyle ( • OH)

Après exposition d’une solution contenant de l’eau et du DMPO (252.5 mM) pendant 120 s à un jet de plasma DBD hélium, nous avons obtenu par mesure RPE le spectre donné figure 7.1.1. Ce spectre est composé de deux entités distinctes : un signal intense (#) (au dessus de 25 000 d’intensité) composé de quatre pics, et un second signal (*) plus faible composé de trois pics.

La légère différence d’intensité entre les pics du même signal provient de l’anisotropie du mélange. Cela signifie que le radical piégé n’est pas dirigé que dans une seule et même direction de l’espace mais qu’il est plutôt réparti de manière aléatoire.

Dans notre cas, la composante principale du signal (#) obtenue avec un piégeur DMPO dans de l’eau milliQ, a une structure 1 :2 :2 :1, et des constantes de couplages hyperfines aN= aH= 15G et un facteur g=2.0056. Ce signal correspond au radical DMPO-OH tra-duisant par conséquent le fait que le jet de plasma génère le radical hydroxyle (•OH) dans l’eau. Ceci est chèrent avec les résultats de la littérature [180, 92, 94, 205, 206, 207, 208].

La composante secondaire du signal (*) est un triplet de plus faible intensité qui a pour constantes de couplages hyperfines aN= aH =15G, g=2.0056. Ce signal peut être attribué à l’adduit de DMPO − CH3 [205]. L’adduit DMPO − CH3 ne peut provenir que de la solution contenant le piégeur. Cette hypothèse semble être confirmée par l’absence de dépendance entre l’intensité du signal et le temps d’exposition des liquides au jet de plasma. Cette observation a également été faite lors des travaux de Tresp et al où différentes solutions de DMPO provenant de différents fournisseurs sont étudiées par RPE avec et sans exposition au plasma. Dans certains cas, un signal identique au notre est observé même en l’absence de traitement plasma [205].

La présence de radical hydroxyle dans les liquides après traitement par jet de plasma peut être attribuée à l’interaction entre les espèces excitées formées par le plasma et les molécules de la surface du liquide. L’observation du radical hydroxyle dans un milieu de culture est issue de deux phénomènes différents. La première voie de production peut être induite par l’interaction d’un atome d’oxygène avec une molécule H2O induisant la création de deux radicaux hydroxyle aqueux [211, 212, 213]. La deuxième voie de production est la solvatation du OH gazeu présent dans le plasma qui devient alors un radical hydroxyle aqueux. La présence d’atomes d’oxygène et de radicaux hydroxyle en phase gazeuse a été observée à partir de leur rayonnement spécifique par spectroscopie d’émission [132]. Cela indique que les deux voies de formation du radical hydroxyle sont probablement actives lors de l’exposition de liquides aux plasmas.

Nous avons évalué la cinétique de décroissance du signal RPE de l’adduit DMPO-OH dans les trois liquides étudiés (eau milliQ, DMEM avec ou sans SVF) exposés 150 s au jet de plasma DBD d’hélium. Cette cinétique est effectuée jusqu’à 2000 s après l’activation des

Figure 7.1.1 – Spectre RPE obtenu après exposition d’une solution eau + DMPO pendant 120 s au jet de plasma hélium

liquides. La figure 7.1.2. donne la décroissance du signal DMPO-OH en fonction du temps dans les trois liquides. L’intensité de l’adduit DMPO-OH à l’instant t = 0s est obtenue par ajustement de la courbe par un polynôme de degré 3 des données expérimentales. Pour un liquide donné, le signal RPE du DMPO-OH décroit en fonction du temps après exposition. Du fait de cette décroissance du signal il est difficile de comparer les signaux dont l’acquisi-tion à été réalisées à deux temps différents après la fin de l’exposil’acquisi-tion au plasma. De plus, le type de solvant utilisé peut influencer la durée de demi-vie de l’adduit. Dans le présent travail, la quantité de radicaux hydroxyle piégés dans les liquides par le piégeur DMPO est estimée à partir de l’intensité du signal RPE de l’adduit DMPO-OH à l’instant t=0s obtenue par extrapolation des courbes de décroissances. Pour s’assurer de la bonne validité du protocole, la mesure d’un échantillon est réalisée 4 fois à 4 temps différents afin d’obtenir une incertitude de mesure.

Cette méthode nous à permis également de vérifier certaines hypothèses concernant la durée de demi vie de l’adduit DMPO-OH en fonction du solvant utilisé. On remarque dans le tableau 7.1 que la durée de demi vie peut être modifiée en fonction du type de solvant. Dans l’eau par exemple, nos expériences ont montré une durée de demi vie de 820s (très proche des 870s théorique [206]) alors qu’elle est de 1043s et 442s respectivement dans le DMEM et le DMEM+10%SVF. Le DMEM étant une solution tamponnée à pH 7,4 cela peut modifier l’état de protonation de l’adduit DMPO-OH et ainsi augmenter sa stabilité. Par contre, pour le DMEM +10%SVF, la présence de protéines et de lipides dans le sérum de veau peuvent participer à sa décomposition en réagissant avec l’adduit.

La quantité de radicaux •OH piégés dans les liquides par le piégeur DMPO est directe-ment liée à l’intensité du signal RPE de DMPO-OH. L’intensité DMPO-OH a été estimée directement à partir de la mi-hauteur du second pic du spectre RPE. Comme le montre

Figure 7.1.2 – Décroissance en fonction du temps de l’intensité du signal DMPO-OH en fonction de la nature du liquide activé par jet de plasma DBD Hélium pendant une durée d’exposition de 150 s.

Type de solvant Demi vie de l’adduit DMPO-OH (s)

Eau milliQ 820

DMEM 1043

DMEM+10%SVF 442

Table 7.1 – Durée de demi vie de l’adduit DMPO-OH en fonction du type de solvant

la figure 7.1.3, la quantité d’adduit DMPO-OH générée dans les liquides augmente de fa-çon linéaire avec le temps d’exposition au jet de plasma (avec un coefficient de régression linéaireR2

EAU = 0, 99, R2

DMEM= 0, 98, R2

DMEM+SVF = 0, 92) indiquant une augmentation de la production de radicaux hydroxyle. Kanazawa et al ont déjà montré la relation linéaire entre la quantité de radicaux •OH dans l’eau et le temps d’exposition à un jet de plasma fonctionnant à l’hélium en utilisant une technique de dosimétrie chimique basée sur la réac-tion de l’acide téréphtalique (TA) avec des radicaux •OH [214].

L’intensité du signal RPE de l’adduit DMPO-OH dans l’eau milliQ est plus élevée d’en-viron 0,36 ± 0,03 par rapport à l’intensité dans le DMEM et 8,25 ± 1,06 dans le DMEM + SVF. Ces observations suggèrent que la quantité de radical•OH détectée par RPE diminue avec la complexité de la composition du milieu. En effet, lorsque des radicaux •OH sont générés dans de l’eau milliQ ils ne sont entourés que de molécules d’eau, de piégeur et de quelques autres radicaux libres. Par conséquent le nombre de réactions chimiques possibles est limité. Lorsque l’on expose des milieux de culture cellulaire au jet de plasma (DMEM± SVF dans notre cas), les radicaux hydroxyle générés peuvent oxyder les composants du milieu de culture comme les acides aminées, les vitamines et les protéines. Ainsi, on as-siste à une compétition entre l’oxydation des biomacromolécules contenues dans les milieux de culture cellulaire et l’action du piégeur DMPO ce qui induit une diminution du signal

observé par spectroscopie RPE.

Figure 7.1.3 – Évolution de la production de OH• dans différents milieux de culture en fonction du temps d’exposition. La seconde transition du quartet DMPO-OH est utilisée pour déterminer l’intensité du signal.

Ces réactions entre les acides aminés et les radicaux •OH ont été prédites par simulation de dynamique moléculaire des réactifs [212] et observées par spectrométrie de masse haute résolution [210]. Ces données indiquent que dans les milieux de culture cellulaires il y a formation et accumulation de composés biologiques oxydés conduisant à une diminution des éléments nutritifs essentiels à la croissance cellulaire. Cela peut expliquer en partie l’effet cytotoxique des liquides activés par plasma observé dans le chapitre précédent sur sphéroïdes HCT116 . De plus, cela suggère que la cytotoxicité des radicaux •OH produits par jet de plasma peut être due principalement à la production d’espèces chimiques cytotoxiques plutôt qu’à un effet direct sur les cellules.