2.4 Titrage des stocks virau

La forme sauvage ainsi que les formes mutées de gp120 sont produites dans les conditions décrites ci-dessus. Afin d’exprimer ces protéines de manière reproductible, dans des conditions standard, les stocks viraux obtenus après amplification (P1) doivent être titrés.

A partir du titre viral, on peut définir un « taux d’infection » standard, connu sous le nom de MOI (Multiplicity Of Infection). Classiquement, les infections sont réalisées à une MOI variant de 1 à 10. Ici, la MOI appliquée a été définie à 8 (c’est-à-dire 8 virus/cellule).

Tous les titres viraux ont été calculés par la méthode des plages de lyse, en infectant des cellules avec différentes dilutions de virus, en les immobilisant avec une couche d’agarose, puis en les colorant avec un colorant vital, 2 à 3 jours après l’infection. De cette

110 – Sf9 110 – 110 – Sf21 HF 24h 48h 72h 96h 120h

façon, en infectant une cellule, un virus peut se multiplier et infecter les cellules avoisinantes, créant ainsi une plage de lyse non colorée. Ces plages de lyse sont ensuite dénombrées (tableau X).

Stock viral 10-6 ₁₀-5 ₁₀-5 ₁₀-4 _Moyenne* Titre viral en

pfu/mL sauvage 16 51 44 ND 85 8,5.107 K121S 6 36 31 ND 42 4,2.107 R419S 10 21 31 ND 51 5,1.107 K421S 5 67 ND ND 59 5,9.107 K432S 4 39 37 ND 39 3,9.107 R419S-K421S 10 64 68 ND 77 7,7. 107 K121S-R419S-K421S 2 5 16 20 11 1,1. 107 K121S-R419S-K421S-K432S 4 25 21 ND 29 2,9.107

Tableau X: calcul du titre viral des différents stocks de virus

* moyenne des plages de lyse dénombrables, ramenée à une dilution de 10-5. Pour la dilution 10-6, le nombre de plages comptées est multiplié par 10. ND : non dénombré ; souvent, les plages de lyse sur les boîtes de dilution 10-4 sont trop nombreuses pour être comptées.

A partir du titre viral, le volume d’inoculum à ajouter aux cellules est défini pour infecter les cellules à une MOI de 8, dans le but de produire la protéine, ou à une MOI de 0,5 afin d’amplifier le stock viral.

Volume d’inoculum = (MOI * nombre de cellules) / titre viral

I-2.5. Production

La culture de cellules en mini-fermenteur permet d’augmenter les volumes de production. Il est néanmoins nécessaire de vérifier, au préalable, que les conditions de production sont identiques pour des cellules infectées en monocouche ou en suspension. Pour cela, deux tests cinétiques sont réalisés en parallèle, avec des cellules cultivées dans une flasque et dans un mini-fermenteur (figure 44). La protéine gp120 produite par des cellules cultivées en monocouche présente des signes de dégradation à partir de 120 h d’infection (apparition de bandes à 70 kDa et 50 kDa environ). En revanche, celle produite en mini- fermenteur semble se dégrader plus rapidement : après 96 h d’infection, la majorité de la protéine est dégradée. Dans les deux conditions, le taux d’expression de la protéine est identique lorsque l’infection dure 72 h.

Figure 44 : test cinétique d’expression de gp120 dans des cellules Sf21 cultivées en monocouche ou en suspension

(A) Des cellules Sf21 (1,75.107 cellules) sont cultivées en monocouche (30 mL final) et infectées avec 3 mL de baculovirus melittine-gp120 sauvage. Des échantillons (200 µL) sont prélevés toutes les 24 h après infection et des aliquots de 40 µL sont analysés sur un gel SDS-PAGE 10%, suivi d’un immunoblot. La protéine gp120 est détectée en utilisant un anticorps primaire dirigé contre gp120 et un anticorps secondaire dirigé contre les IgG de chèvre. La position des marqueurs de poids moléculaire est indiquée à gauche de la figure. Le 1er puits (st) contient l’équivalent de 100 ng de gp120. (B) Des cellules Sf21 (25.106 cellules) sont cultivées en suspension dans un mini-fermenteur (50 mL final) et infectées avec 5 mL de baculovirus melittine-gp120 sauvage. L’analyse est réalisée dans les mêmes conditions que (A).

Toutes les productions sont donc réalisées en infectant des cellules cultivées en mini- fermenteur pendant une durée de 72 h, à une MOI de 8. Dans ce cas, les cellules sont adaptées en mini-fermenteur 3 jours avant l’infection puis comptées. Lorsque la quantité de cellules avoisine 5.108 cellules, elles sont infectées à une MOI de 8 puis remises en culture à une densité de 0,5.106 cellules/mL, pendant 72 h. De cette façon, la protéine gp120 est produite dans un litre de milieu de culture, à un taux estimé à 25-30 mg de gp120 par litre.

I-2.6. Purification

La protéine gp120 est purifiée à partir du surnageant de culture, en trois étapes successives. Les chromatogrammes obtenus au cours des purifications sont présentés pour la forme sauvage de gp120. Toutes les protéines mutées ont été purifiées selon le même protocole.

I-2.6.1. Purification sur résine échangeuse de cations

La première étape de purification consiste à réaliser une chromatographie échangeuse de cations, à pH 8,2. Le surnageant de culture est chargé sur la résine SP sépharose, puis la colonne est lavée avec le tampon de charge en présence de 0,3% P20 (détergent ajouté afin d’éliminer une protéine de baculovirus qui coélue avec gp120 – cf discussion) jusqu’à stabilisation de l’absorbance à 280 nm, afin de décrocher les protéines fixées de façon non

180 – 130 – 100 – 72 – 55 – 43 – 180 – 130 – 100 – 72 – 55 – 43 – – – – – – – – – – – – – st 0h 24h 48h 72h 96h 120h (A) (B) 180 – 130 – 100 – 72 – 55 – 43 – 180 – 130 – 100 – 72 – 55 – 43 –

spécifique. Enfin, un gradient de sel permet d’éluer les protéines chargées positivement à pH 8,2, accrochées sur la résine (figure 45). L’absorbance à 280 nm permet de suivre l’élution. Les protéines sont éluées entre 0 et 0,5 M NaCl, avec un maximum d’absorbance à 0,25 M NaCl.

Figure 45 : chromatogramme correspondant à l’étape de purification sur une résine échangeuse de cations

En bleu : absorbance à 280 nm / En vert : gradient théorique/ En marron : conductivité / En rouge : fractions Après infection pendant 72 h, le surnageant de culture est déposé sur une colonne de SP sépharose. Les protéines fixées de façon non spécifiques sont décrochées par un lavage de la résine avec du tampon 50 mM HEPES pH 8,2, puis avec ce même tampon additionné de 0,3% P20. Les protéines fixées sont ensuite éluées par application de deux gradients de sel successifs. Des fractions de 2 mL sont recueillies.

Vingt microlitres des fractions correspondant au pic d’absorbance sont analysés sur un gel SDS-PAGE, coloré au bleu de Coomassie (figure 46). Les fractions 13 à 20 possèdent la protéine gp120 (bande majoritaire à 110 kDa environ). Les fractions sont également analysées par Western Blot afin de vérifier que la bande visible à 110 kDa correspond bien à gp120 (résultats non présentés). Les fractions contenant gp120 sont réunies et déposées sur une colonne de lentil-lectine. 600 mAU 400 200 0 0 10 20 30 40 50 60 mL

Figure 46 : analyse sur un gel SDS-PAGE des fractions recueillies au cours de l’étape de purification sur la résine échangeuse de cations

Vingt microlitres de chaque fraction, additionnés de 5 µL de bleu de dépôt 5X, sont déposés sur un gel SDS- PAGE 10%, coloré au bleu de Coomassie.

I-2.6.2. Purification sur résine d’affinité

La lentil-lectine est une protéine présentant une forte affinité pour les glycoprotéines et les polysaccharides possédant des sucres de type glucose ou mannose. Après passage de l’échantillon, la résine de lentil-lectine est lavée avec du PBS, puis les protéines retenues sont éluées avec du PBS, 1 M Méthylmannopyrannoside. Quarante microlitres des fractions (500aµL) correspondant au pic d’absorbance à 280 nm sont analysés sur un gel SDS-PAGE, coloré au bleu de Coomassie (figure 47). Les fractions 10 à 18, analysées sur un gel SDS- PAGE coloré au bleu de Coomassie, contiennent gp120. Cette deuxième étape permet d’éliminer certaines protéines « contaminantes » et augmente le degré de pureté de gp120 (Figure 47C). 180 – 130 – 100 – 72 – 55 – 43 – 34 – 10 12 14 16 18 20 22 24

Figure 47 : étape de purification de gp120 sur une résine de lentil-lectine.

(A) Chromatogramme. En bleu : absorbance à 280 nm / En rouge : fractions.

Les fractions sélectionnées suite à l’étape de purification sur colonne échangeuse de cations sont réunies et déposées sur une résine de lentil-lectine. Les protéines fixées de façon non spécifique sont éliminées en rinçant la résine avec du PBS. Les protéines fixées, glycosylées, sont décrochées grâce au passage d’une solution de 1 M méthylmannopyranoside. Des fractions de 500 µL sont récoltées au cours de l’élution. (B) quarante microlitres des fractions correspondant au pic d’absorbance sont analysés sur un gel SDS-PAGE, coloré au bleu de Coomassie. (C) Analyse sur un gel SDS-PAGE, coloré au bleu de Coomassie, de l’échantillon avant purification sur la résine de lentil-lectin (1), des fractions non retenues sur la lentil lectine (2) et de l’échantillon élué avec 1M méthylmannopyranoside (3). Les marqueurs de poids moléculaires sont indiqués à gauche des figures.

Les fractions 10 à 18 sont réunies, déssalées et concentrées (volume final 250 µL) à l’aide d’une cellule Amicon possédant une membrane retenant les protéines de masse moléculaire supérieure à 30 kDa.

I-2.6.3. Purification par chromatographie d’exclusion

La dernière étape de purification permet de séparer les protéines selon leur taille, afin d’isoler gp120. L’échantillon concentré est injecté sur la colonne et des fractions de 500 µL sont recueillies au cours de l’élution puis analysées sur un gel SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie (figure 48). La protéine gp120 est éluée majoritairement dans les fractions 26 à 28, correspondant au dernier pic d’absorbance élué. Ce résultat est surprenant puisque les protéines « contaminantes » de l’échantillon présentent un poids moléculaire inférieur à celui de gp120 (figure 47B) et devraient, de ce fait, être éluées après gp120. Cela suggère que les

65 70 75 80 85 mL mAU 350 300 250 200 150 100 50 0 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Fractions (40 µL) 180 – 130 – 100 – 72 – 55 – 43 – (B) 180 – 130 – 100 – 72 – 55 – 43 – 34 – 1 2 3 (C) (B) (A)

protéines résiduelles existent sous la forme de multimères ou d’agrégat. Les fractions 26 à 28 sont réunies et concentrées.

Figure 48 : étape de purification de gp120 par chromatographie d’exclusion

(A) Chromatogramme. En bleu : absorbance à 280 nm / En rouge : fractions. Les fractions sélectionnées suite à la seconde étape de purification sont réunies, déssalées et concentrées. L’échantillon obtenu est injecté sur une colonne d’exclusion Superdex 200, afin de séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire. Des fractions de 500 µL sont recueillies au cours de l’élution. (B) Cinquante microlitres des fractions correspondant aux pics d’absorbance sont analysés sur un gel SDS-PAGE, coloré au bleu de Coomassie. Les marqueurs de poids moléculaires sont indiqués à gauche de la figure.

I-2.6.4. Récapitulatif des différentes étapes de purification

Les étapes de purification sont récapitulées dans la figure 49. Ce gel SDS-PAGE permet d’évaluer approximativement le degré de pureté de gp120. Chaque étape de purification permet d’affiner le degré de pureté de gp120. La chromatographie d’exclusion est une étape limitante du point de vue du rendement. En effet, pour obtenir une protéine bien pure (à environ 95%), seules les trois fractions correspondant à l’apex du pic (figure 48) ont été retenues, diminuant ainsi le rendement. Les quantités de protéine gp120 obtenues à l’issue de ces trois étapes sont suffisantes pour la suite de l’étude.

180 – 130 – 100 – 72 – 55 – 43 – 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Fractions (50 µL) (A) (B) mAU 200 150 100 50 0 0 5 10 15 20 mL

Figure 49 : récapitulatif des étapes de purification/concentration de gp120

A chaque étape de purification, des aliquots sont prélevés et analysés sur un gel SDS-PAGE 10%, coloré au bleu de Coomassie afin d’évaluer les rendements de purification. (1) Echantillon purifié par chromatographie échangeuse d’ions. (2) Echantillon obtenu à l’issue de la chromatographie d’affinité. (3) Concentration de l’échantillon précédent. (4) Echantillon obtenu à l’issue de l’étape de chromatographie d’exclusion. La position des marqueurs de poids moléculaire est indiquée à gauche de la figure.

I-2.6.5. Purification des autres formes recombinantes de gp120

Les protéines mutantes ont subi le même protocole de purification que la forme sauvage de gp120 (figure 50). Pour chacune de ces protéines, le degré de pureté est estimé à environ 95%. Ces protéines sont enfin dosées par analyse d’acides aminés, sur un analyseur de type « Biochrom 30 ». Ces trois étapes de purification permettent d’obtenir 1 à 2 mg de protéine pure à partir d’un litre de milieu de culture.

Figure 50 : purification des formes mutantes de gp120

Les formes mutantes de la protéine recombinante gp120 sont produites et purifiées dans les mêmes conditions que la forme sauvage de gp120. Trois microgrammes de chaque protéine sont déposés sur un gel SDS-PAGE 10% coloré au bleu de Coomassie, afin d’analyser le degré de pureté de chaque protéine recombinante (en haut). Un Western Blot est réalisé, en parallèle, en déposant 500 ng de chaque protéine recombinante (en bas). La protéine gp120 est détectée en utilisant un anticorps primaire dirigé contre gp120 et un anticorps secondaire dirigé contre les IgG de chèvre. La position des marqueurs de poids moléculaire est indiquée à gauche des figures. 180 – 130 – 100 – 72 – 55 – 43 – 34 – 1 2 3 4 180 – 130 – 100 – 72 – 180 – 130 – 100 – 72 – wt 121 419 421 432 2M 3M 4M 3µg 500ng