2.3 Choix du type cellulaire et du plasmide le mieux adapté

Les bacmides recombinants possédant les formes sauvage ou mutées de gp120 sont purifiés et utilisés pour transfecter des cellules d’insectes Sf21 afin de générer un stock viral P0. A partir de ce stock viral, des cellules Sf21 sont infectées en plus grande quantité pour générer un stock viral P1 plus important et plus concentré en virus. Ce stock P1 permet d’infecter des cellules avec une MOI de 8 (cf matériel et méthodes II-4.4.) afin de produire gp120. Les conditions de production sont, dans un premier temps, optimisées avec la forme sauvage de gp120. Deux bacmides ont, en effet, été créés à partir des plasmides pFastbac- gp120 et pNT-Bac-gp120 : ces bacmides diffèrent essentiellement par l’origine du peptide signal : egt pour le premier et la melittine pour le second. Par ailleurs, différents types cellulaires peuvent être infectés pour produire la protéine ; quatre types ont été testés pour définir les meilleures conditions de production, au niveau des quantités produites et du niveau de glycosylation.

3700 pb –

I-2.3.1. Choix du bacmide

Classiquement, au laboratoire, les productions de protéines sont réalisées dans des cellules HF (HighFive ou Hi5). La production à partir des deux types de bacmides a donc été réalisée à partir de ces cellules.

Des stocks viraux, réalisés à partir de cellules transfectées avec les bacmides issus de pFastBac-gp120 et pNT-Bac-gp120, sont utilisés pour infecter des cellules HF. Une cinétique d’infection est réalisée dans les deux cas, afin de définir le temps optimal d’infection (figure 41). Trente microlitres de surnageant de culture sont analysés par Western Blot. Dès 24 h d’infection, la protéine gp120 commence à être sécrétée, quel que soit le peptide signal (signal un peu plus marqué avec le peptide signal de la melittine). Dans les deux cas, le temps optimal d’infection est défini à 72 h. A 96 h, la protéine semble commencer à se dégrader, en particulier pour la protéine produite avec le peptide signal de la melittine (figure 41B) : une bande immunoréactive apparaît à une taille de 60 kDa.

Aucune différence notable n’est remarquée entre la production de gp120 à partir du plasmide pFastBac (contenant la séquence signal d’egt) et du plasmide pNT-Bac (possédant le peptide signal de la melittine). La production de gp120 est donc poursuivie, de façon arbitraire, en infectant les cellules avec des baculovirus melittine-gp120.

Figure 41 : test cinétique d’expression de gp120 dans des cellules HF

Des cellules HF (1,75.107cellules) ont été infectées avec 5 mL de baculovirus egt-gp120 sauvage (A) ou de baculovirus melittine-gp120 sauvage (B). Des échantillons (1 mL) sont prélevés toutes les 24 h après l’infection et des aliquots de 30 µL sont analysés sur un gel SDS-PAGE 10%, suivi d’un immunoblot. La protéine gp120 est détectée en utilisant un anticorps primaire dirigé contre gp120 et un anticorps secondaire dirigé contre les IgG de chèvre. La position des marqueurs de poids moléculaire est indiquée à gauche de la figure. Le 1er puits (st) contient l’équivalent de 100 ng de gp120. 130 – 100 – 72 – 130 – 100 – 72 – st 0h 24h 48h 72h 96h (A) (B)

I-2.3.2. Choix du type cellulaire

La production de gp120 à partir de cellules HF infectées conduit à une protéine qui présente un profil de migration hétérogène (figure 42). La protéine gp120 produite et purifiée, analysée sur gel SDS-PAGE 10% coloré au bleu de Coomassie, présente, en effet, une masse moléculaire variant entre 65 kDa et 120 kDa. Une fois traitée à la N-glycosidase, gp120 présente un poids moléculaire homogène d’environ 60 kDa, correspondant à la partie protéique, déglycosylée, de gp120. La protéine gp120 possède, en effet, en moyenne 25 sites de N-glycosylations, ces glycosylations représentant plus de 50% de la masse totale de la protéine805 (cf bibliographie II-1.2.3.). Ces résultats laissent penser que les glycosylations de gp120 réalisées par les cellules HF sont incomplètes et hétérogènes ; ceci paraît surprenant car les HF sont généralement choisies pour la production de protéines glycosylées.

Figure 42 : vérification des glycosylations de gp120 produite en cellules d’insectes

Dix microgrammes de la protéine gp120 produite en cellules d’insectes ont été traités (+) ou non (-) par 1U de N-glycosidase, une nuit à 37°C, puis analysés sur un gel SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie. Les marqueurs de poids moléculaires sont indiqués à gauche de la figure.

La production de gp120 à partir de l’infection d’autres cellules d’insectes est alors testée, afin de déterminer si le profil de glycosylation est plus homogène. Quatre types cellulaires (Sf21, Sf9, Mimic Sf9 et HF) sont infectés avec le stock viral réalisé à partir de cellules transfectées avec le bacmide melittine-gp120 sauvage. Une cinétique d’infection est réalisée entre 0 h et 120 h (figure 43). La quantité de protéines produite par les cellules HF est supérieure à celle exprimée dans les trois autres types cellulaires. Néanmoins, le profil de migration homogène suggère une glycosylation plus aboutie pour les protéines produites par les cellules Sf9 ou Sf21. Dans les Sf21, la quantité produite augmente au cours du temps, jusqu’à 120 h, sans signe apparent de dégradation. En revanche, la protéine produite par les cellules Sf9 se dégrade à partir de 96 h d’infection. Les cellules Mimic Sf9, qui sont des Sf9 modifiées pour produire des protéines sialylées (cf discussion), expriment très faiblement gp120 (résultats non présentés).

805 _{Korber, B., Gaschen, B., Yusim, K., Thakallapally, R., Kesmir, C. and Detours, V. (2001) Br Med Bull 58, 19-42}

180 – 130 – 100 – 72 – 55 – 43 – - + N-glycosidase

Figure 43 : test cinétique d’expression de gp120 via le système baculovirus, dans différents types cellulaires

Les cellules Sf9, Sf21 ou HF (1,75.107cellules) sont infectées avec les baculovirus melittine-gp120 sauvage, à une MOI de 8. Des échantillons (1 mL) sont prélevés toutes les 24 h après l’infection et des aliquots (40 µL pour les cellules Sf9, 50 µL pour les Sf21 et 20 µL pour les HF) sont analysés sur un gel SDS-PAGE 10%, suivi d’un immunoblot. La protéine gp120 est détectée en utilisant un anticorps primaire dirigé contre gp120 et un anticorps secondaire dirigé contre les IgG de chèvre. La position des marqueurs de poids moléculaire est indiquée à gauche de la figure.

NB : pour le test réalisé avec les cellules HF, la cinétique a été stoppée à 96 h, au vu des résultats obtenus précédemment (figure 41).

Au vu de ces résultats, les conditions optimales de production retenues sont donc : une infection de cellules Sf21, pendant 72h, avec un stock viral issu d’une transfection par un bacmide pNT-Bac-gp120. La protéine gp120 est alors sécrétée dans le milieu de culture, grâce à la séquence signal de la melittine.