Les iPSC représentent un grand espoir pour la thérapie cellulaire et les applications en médecine régénérative, notamment en apportant une source cellulaire qui pourrait être spécifique d’un patient donné. Grace à leur capacité d’auto-renouvellement et la différenciation indéfinie dans tous les types de de cellules du corps humain y compris le cardiomyocytes, les iPSC pourrait théoriquement être une source illimitée de cellules cardiaques humaines utiles pour des approches de remplacement cellulaire. Cependant, le développement des nouvelles techniques de reprogrammation sans utilisation de transgènes ont été développé dans ce but.
L’utilisation des cellules souches pluripotentes induites en application thérapeutiques pose des problèmes spécifiques. Tout d’abord, le maintien de cellules conservant un état pluripotent peut provoquer la tumorogenèse après transplantation. De même, il a été proposé que ces cellules ne fussent pas immunogènes mais il semble que cette donnée soit liée au degré de différenciation obtenu. Ainsi, d'autres problèmes comprennent la faible efficacité de la production de cardiomyocytes et la variabilité d'une lignée cellulaire à une autre. Compte tenu de l'évolution rapide des technologies dans ce domaine, il est possible que ces obstacles techniques seront bientôt surmontées, et que les approches fondées sur iPSC se révélera être utile pour le traitement d’insuffisance cardiaque et leur l’application dans la recherche clinique.
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À ce jour, une grande variété de différents types de cellules souches ont été étudiées pour leur capacité à réparer le cœur infarci à la fois études animales et dans la recherche clinique chez humain (Lovell et al, 2010). La découverte des iPSC a ajouté une source cellulaire supplémentaire qui peut avoir une application clinique potentielle dans ce domaine, bien que la recherche en médecine régénérative utilisant ces cellules souche soit encore à un stade expérimentale (Yoshida et al, 2011). Cependant, l'enthousiasme pour l'utilisation des iPSc en médecine régénérative a été entravé par les problèmes de plus en plus reconnus de l’instabilité génétique de ces cellules et leur potentiel à présenter une différenciation non maitrisée.
A ce jour, les maladies rétiniennes dégénératives font l’objet de phases de test pour des traitements par therapies basées sur des iPSC. Ces premières études cliniques sont cependant retardées par les difficultés à produire des cellules iPS de grade clinique et satisfaisant l’ensemble des critères de contrôle sécurité. Dans le domaine de la recherche en cardiologie, quelques études utilisant des iPSC pour traiter l’insuffisance cardiaque ischmique ont été récemment rapportées. Nelson et al, ont démontré qu’après l’injection des IPSc dans des zones infarcies chez la souris, ces cellules exogènes ont donné naissance à de nouveaux cardiomyocytes qui peuvent se greffer sans perturber l’architecture globale du cœur. Ils ont aussi constaté que le traitement avec les iPSC a rétabli la contractilité, l’épaisseur de la paroi ventriculaire et la stabilité électrique du cœur. Ces cellules ont aussi participé dans la régénération du tissu cardiaque, du muscle lisse et du tissue endothéliale (Nelson et al, 2009). Dans une autre étude de preuve de concept Mauritz et al, ont montré que l’injection d’IPSc trié pour une population des cellules progénitrices Flk+ d’un myocarde infarci améliore la fonction cardiaque après l’infarctus. Ces cellules sont capables de se différencier en cellules des lignées cardiovasculaires in vitro comme in vivo (Mauritz et al, 2011). Les études de greffe de CM dérivés d’iPSC chez des mammifères sont en plein développement. Récemment un essai d’allogreffe de CM dérivés d’iPSC a été réalisé chez les primates. Il a été basé sur l’allogreffe de CM d’iPSC de singe. Les singes ont subi une opération visant à créer une ischémie suivie d’une reperfusion du cœur, afin de mimer un infarctus du myocarde. Deux semaines après l’intervention, des CM issus d’iPSC ou seulement le véhicule ont été injectés dans la zone infarcie et la zone en bordure de l’infarcissement. Les animaux ont été sacrifiés 12 semaines après la transplantation. Dans les deux groupes étudiés, aucune formation de tératome n’a été observée. Dans cette étude il a été démontré que les CM issus d’iPSC de singe se sont correctement intégrés et couplés au receveur, ils participent à la fonction contractile du cœur et en améliorent la force contractile dans ce modèle d’infarctus bien que des effets paracrines notamment puissent également rentrer en jeu (Shiba et al, 2016).
Cet effet paracrine a été étudié chez la souris dans le cadre d’une cardiomyopathie induite par la Doxorubicine. Ce composé est souvent utilisé en chimiothérapie. Ce médicament peut induire une
75 cardiomyopathie et a permis de développer un modèle de cardiomyopathie chez la souris. Dans cette étude les chercheurs ont comparé la thérapie cellulaire basée sur l’injection de cellules mésenchymateuses (MSC) dérivées de la moelle osseuse ou dérivées d’iPSC. Les auteurs ont constaté que les cellules dérivées d’iPSC produisent des effets bénéfiques plus importants grâce à des réponses anti-oxydantes et anti-apoptotiques plus fortes ; ces effets contribuent à une efficacité thérapeutique supérieure dans l'atténuation de la cardiomyopathie induite par la Dox. En comparaison avec des cellules dérivées de la moelle osseuse, les MSC d’iPSC secrètent des cytokines impliquées dans des mécanismes anti-apoptotiques, anti-inflammatoires, anti-oxydatifs, et permettent également la régulation de la mobilisation et la réactivité cellulaire (Zhang et al, 2015).
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Chapitre 3 : EDITION DU GENOME
L’édition génomique (anglais : genome editing) ou « édition du génome avec des nucléases modifiées » regroupe un ensemble de techniques de manipulations du génome via la « réécriture du matériel génétique ». Cette technique peut être appliquée aux plantes, animaux, champignons et microbes, et surtout au génome humain. Les techniques d’édition de génome regroupent des techniques de génie génétique dans lesquelles un ou plusieurs morceaux d'ADN sont insérés, remplacés ou retirés d'un génome en utilisant des nucléases artificiellement modifiées et qui fonctionnent comme des «ciseaux moléculaires». Le mot anglais « editing » évoque le vocabulaire de l’informatique et la fonction « couper-coller ». Ces « ciseaux » sont des nucléases : des enzymes de restriction qui peuvent sectionner le double-brin d’ADN à des emplacements précis. Mais à la différence des enzymes de restriction qui reconnaissent des séquences consensus fréquentes dans un génome, les outils d’édition génique sont capables de cibler une séquence précise d’un génome. En théorie, ces outils permettent donc de cibler précisément un locus donné d’un génome annoté.
L’ensemble des outils ont une fonction nucléase qui crée une coupure double brin de l’ADN. Les cellules répondent à ces coupures par des mécanismes de réparation d’ADN selon deux mécanismes principaux :
La jonction d'extrémités non homologues (en anglais Non-Homologous End-Joining ou NHEJ). C’est un mécanisme non-conservatif, de réparation de l’ADN. Il permet de réparer des lésions provoquées par des cassures double brin. Cette réparation peut conduire à un changement de l’information génétique, généralement une délétion et plus rarement une insertion. Si la cassure survient à l’intérieur d’un gène ceci peut conduire à modifier le cadre de lecture. Cette approche peut donc permettre d’éteindre l’expression d’un gène (knock out). Pour effectuer, cette réparation la cellule emploi la protéine Ku70/80. Cette protéine interagit avec les deux extrémités d’ADN résultant de la cassure. Cette protéine agit par essais et erreurs pour tenter d’établir une interaction transitoire entre les deux extrémités d’ADN. Pour cela la protéine Ku possède plusieurs activités :
une activité de nucléase pour éliminer les nucléotides endommagé par la cassure et incompatibles avec la ligature des extrémités. La protéine Ku permet de produire des extrémités 5'-phosphate et 3'-OH compatibles avec la suture des brins par l'ADN ligase.
Recrutement d’autres protéines impliquées dans la réparation : Une protéine-kinase ADN dépendante (DNA-PK), une ADN ligase spécifique, une terminal-transférase.
La protéine Ku70/80 vérifie s’il y a une homologie de 2 à 4 bases et donc si l’hybridation est possible. La jonction est stabilisée et la cassure est transformée en deux lésions simples brin. Le brin
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complémentaire est synthétisé par une ADN polymérase à partir du brin qui vient être réparé par la protéine Ku. La protéine Ku a aussi un rôle de l’ADN ligase qui reforme les liaisons phosphodiester.
La recombinaison homologue :
C’est une recombinaison génétique où les séquences de nucléotides sont échangées entre des molécules d’ADN identique ou similaires. Elles sont utilisées pour réparer les cassures doubles brin. Elle permet de créer de nouvelles combinaisons pendant la méiose. La recombinaison homologue est aussi utilisée par les bactéries et les virus pour s’échanger le matériel génétique. Ce mécanisme est appelé le transfert de gène horizontal. La recombinaison homologue suit une série d’étapes :
1) la résection qui consiste à supprimer une section d’ADN autour des extrémités 5’ de la lésion
2) l’invasion du brin où les extrémités de 3’ restantes autour de la lésion se fixent à une molécule intacte d’ADN de séquence similaire
3) la formation de la « jonction de Holliday » qui se fait la connexion de molécules 4) la coupure de brins pendant la méiose par des enzymes
5) la réparation d’ADN
Le phénomène de recombinaison est conservé au sein de tous les domaines de la vie, et même des virus, suggérant qu'il s'agit d'un mécanisme biologique universel. Une dysfonction de ces gènes étant corrélée avec l'apparition de plusieurs types de cancers, les protéines concernées font l'objet de recherches actives.
La technique de « gene targeting » ou de « genome editing » utilise le principe de la recombinaison homologue avec l’objectif d’introduire des changements dans le génome. Les premières tentatives de modification des génomes ont consisté à modifier des séquences génétiques en utilisant uniquement la recombinaison homologue. Ce mécanisme de maintenance naturel de l’ADN permet de réparer un brin d’ADN en utilisant comme modèle une séquence homologue située sur un autre brin. Il est possible d’induire des recombinaisons homologues entre l’ADN naturel d’une cellule et un brin d’ADN exogène introduit par les chercheurs, en utilisant comme vecteur le génome modifié empaqueté dans un système vecteur par exemple. Le phénomène de recombinaison est suffisamment souple pour qu’il soit possible d'introduire un certain niveau de changement (ajout, suppression ou modification d’une portion d’ADN) au niveau de la zone d’homologie visée. Dès les années 1980, Mario R. Capecchi et Oliver Smithies ont travaillé sur la recombinaison homologue de l'ADN comme outil de « ciblage de gène », c’est-à-dire comme instrument d’inactivation ou de modification de gènes précis. Avec la collaboration de Martin J. Evans, ils ont mis au point un procédé permettant de modifier le génome de souris en modifiant l’ADN de cellules souches embryonnaires murines en culture, et en injectant ces cellules souches modifiées dans des embryons de souris. Les souris génétiquement modifiées ainsi
79 générées permettent d’étudier des maladies humaines en laboratoire. C’est aujourd'hui un outil couramment utilisé en recherche médicale. Les travaux des trois chercheurs leur ont valu le Prix Nobel de physiologie ou médecine en 2007.
Différents outils provoquant une cassure de l’ADN ont été découverts et améliorés. Les premiers outils coupaient les deux brins de l’ADN, par la suite la modification de ces outils a permis d’obtenir des cassures simple brin. Le chapitre suivant présente les différents outils disponibles à l’heure actuelle ainsi que leurs modes de fonctionnement.