La découverte la plus récente de nucléase est la découverte de CRISPR. Ce concept est adapté à partir du système immunitaire des bactéries et archées, qui reconnaissent une séquence spécifique de l'ADN viral et, pour le dégrader, utilise une endonucléase guidée par un ARN guide. Les fragments d’ADN de l’envahisseur sont intégrés comme des espaceurs dans le locus CRISPR. Les locus CRISPR produit les crRNAs (ARNs CRISPR) qui contient une séquence unique complémentaire à la séquence l’ADN cible (protospacer) et une séquence répété qui s’hybride a une petit séquence d’ARN qui s’appelé tracrRNA (ang : transactivated crRNA). L’hybride crRNA/tracrRNA guide les protéines CAS (ang : CRISPR-associated system) sur l’ADN et permet au complexe de cibler pour cliver cet ADN. Depuis 2013, il y avait plusieurs publications apportant l’utilisation de ces systèmes pour l’édition génomique sur des cellules humaines (Jinek et al, 2013, Mali et al, 2013). Le clivage à l’aide du système CRISPR/Cas9 dans des cellules humaines nécessite l’introduction d’un vecteur exprimant la CAS9 et les ARNs guides (crRNA et tracrRNA). Par une fusion de ces deux ARNs dans un ARN chimerique les chercheurs ont réussi à simplifier ce système (Cho et al, 2013). Pour cibler la CAS9 sur l’ADN cible il suffit de cloner une séquence de 20bp dans la région espacer dans le locus crRNA. Plusieurs versions des plasmides CRISPR/Cas9 sont disponibles auprès des services de partage de plasmides. En raison de la petite taille de l’ARN guide, il est possible de fournir plusieurs ARN guide au même temps pour obtenir un ciblage multiplex (Cong et al, 2013). Ding et al, ont comparé les CRISPRs et TALENs en ciblant la même région dans le génome des iPSC. Les Cas9 ont été plus performant dans la perturbation de gènes, l’introduction des gènes et du ciblage bi-allélique. Les chercheurs pensent que ceci est possible à cause du niveau d'expression plus élevé et la plus faible cytotoxicité de la protéine Cas9. Malgré sa polyvalence, le système / cas9 CRISPR présente plusieurs limites. Tout d’abord les sites ciblés par le Cas9 sont limitées par la nécessité d’un motif spécifique : GN20GG. La reconnaissance de la cible par le complexe Cas9 nécessite la présence d'un motif de séquence spécifique immédiatement en aval de la séquence 20 nucléotidique cible par gARN et qui est le motif adjacent protospacer (PAM). La séquence PAM pour CRISPR-Cas9 dérivés de Streptococcus pyogenes est NGG. Ceci peut poser un problème pour cibler certains loci. Le deuxième limite de ce système est que le système tolère jusqu’à 6 « mismatchs » entre le crRNA et ADN cible. Ceci peut avoir comme conséquence un effet hors cible. En effet, une
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étude a montré que les nucléases CRISPR / Cas9 induisent des mutations au niveau des sites hors-cible avec un maximum de cinq « mismatchs » (Fu et al, 2013). Le système CRISPR/Cas9 a été converti en une nickase, qui provoque une coupure simple brin de l’ADN. Ainsi, dans ce sytème, deux nickases sont combinées pour cibler et couper un ADN donné. Cette approche réduit la mutagenèse sur des sites hors-cible (Cong et al, 2013).
Figure 22 : Representation de CRISPR
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CRISPRi et CRISPRa
La nucléase Cas9 peut être convertie en Cas9 désactivé (dCas9) pour une liaison à la protéine ADN- ARN programmable par mutation de deux résidus clés dans les domaines de nucléase. Ce système peut être utilisé pour activer ou désactiver des gènes.
CRISPRi
Dans le cas le plus simple, dCas9 peut réprimer la transcription en interférant stériquement avec l'initiation de la transcription ou l'élongation en étant ciblée sur le gène d'intérêt avec un guide ARN convenablement choisi (Jinek et al, 2012). La résistance à la répression est fortement dépendante de la position par rapport au promoteur de la cible, ainsi que la nature du promoteur lui-même. Chez les procaryotes, la répression jusqu'à 1000 x a été atteinte lors du ciblage dCas9 sur un brin d'ADN dans un promoteur ou sur un brin d'ADN en aval (Nielsen et al, 2014). Toutefois, dans des cellules eucaryotes la répression stérique est plus faible : jusqu'à 2x et 20x avec des promoteurs naturels de mammifère et des cellules de levure. Comme une exception notable, des promoteurs synthétiques spécialement conçus pour la répression directe par dCas9 peuvent être réprimées jusqu'à 100x dans des cellules de mammifères (Kiani et al, 2014). Potentiellementune répression plus forte dans des cellules eucaryotes peut être obtenue en fusionnant dCas9 avec les domaines répresseurs de la transcription. Une répression jusqu’à 50x a été réalisée à l'aide d'une fusion avec un répresseur transcriptionnel MXI1 dans la levure (Gilbert et al, 2013). Dans les cellules de mammifères, dCas9 est fusionné avec l'histone déméthylase LSD1 (Kearns et al, 2015). Ceci peut également être utilisé pour réprimer la transcription par des amplificateurs distaux. Le système le plus largement utilisé dCas9-KRAB fusion est responsable d’une liaison forte et hautement spécifique à la fois chez la levure et dans des cellules de mammifères (Zalatan et al, 2015).
CRISPRa
L'activation transcriptionnelle peut également être obtenue en convertissant la dCas9, les ARN guides, dans un système de trans-activation nommé CRISPRa. Dans E. coli, un activateur a été construit par fusion de la unité ω de l'ARN polymérase native avec la dCas9 chez un hôte déficient pour sous-unité ω (Bikard et al, 2013). Cet activateur est modérément actif avec des promoteurs faibles (jusqu'à 23 x d'activation). Les activateurs le plus simples chez l’eucaryotes peuvent être conçus en fusionnant dCas9 avec VP64 (et ses variations), EDLL, TAD, p65, et les domaines p300core effectrices. Les niveaux d'activation en utilisant un seul ARN guide pour cibler un promoteur sont généralement faibles.
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Cependant, l'activation peut être augmentée de façon appropriée en utilisant avec plusieurs ARN guides pour cibler un promoteur. Cette observation a conduit à la construction d'activateurs qui contiennent plusieurs domaines effecteurs dCas9 par molécule. Tout d'abord, trois domaines d'activation différents (VP64, p65, et Rta) ont été fusionnés pour former un activateur appelé VPR (Chavez et al, 2015). Cet activateur était 1 à 2 x plus efficace qu'une simple fusion de VP64. En second lieu, dCas9 a été fusionné avec Suntag, un peptide contenant une matrice de plus de 10 répétitions en tandem. Chaque répétition a ensuite recruté un activateur VP64 de transcription fusionné à un fragment d'anticorps modifié génétiquement scFv. Un inconvénient potentiel de ce système est de nature encline à l'agrégation des scFv. Néanmoins, l'activation de la transcription d'environ 50 fois a été obtenue en utilisant cet activateur guidé par un seul ARN guides dans les cellules K562 humaines
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