La cible antigénique des anticorps de TIH, le FP4 modifié par l’héparine, a été identifiée par Jean Amiral en 1992. Dès lors, les premiers tests immunologiques, basés sur une technique Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), ont rapidement été développés afin de fournir des outils relativement rapides et simples de réalisation pour le diagnostic de la TIH et ne nécessitant pas de plaquettes humaines. Actuellement, plusieurs trousses sont commercialisées et présentent des différences de réactivité principalement expliquées par le type de complexe antigénique, la technique utilisée et impliquant le FP4 (FP4/H, FP4/ polyvinylsulfonate, lysat plaquettaire/H) (tableau 8). Ces tests ELISA détectent de fa on très sensible les anticorps circulants anti-FP4 modifié mais avec une spécificité plus
57
Figure 7 : Principe du test ELISA direct.
Considérant que les anticorps pathogènes sont d’isotype IgG, des trousses détectant spécifiquement cette classe d’immunoglobuline ont été développées mais leurs performances
ne sont que très peu modifiées (Ss 98 % vs. 96 % ; Sp 85 % vs 86 %) [119]
. En l’absence de test fonctionnel disponible, il est toutefois à ce jour recommandé de les utiliser
préférentiellement [120]. Une corrélation positive existe entre le score de probabilité clinique
(4Ts) et la densité optique (DO) mesurée en ELISA. Ainsi, la TIH pourrait être exclue en cas de score intermédiaire associé à un ELISA faiblement positif (DO < 1). l’opposé, la probabilité post- test de TIH est supérieure à 99 % en cas de score élevé associé à un ELISA
très positif (DO 2) [121]. Cet exemple souligne l’importance d’un rendu quantitatif des
résultats des tests ELISA afin d’aider au mieux les cliniciens dans leur démarche diagnostique.
Une autre stratégie, permettant d’augmenter les performances des tests ELISA, propose une étape d’inhibition du test en apportant de l’héparine à forte concentration dans le milieu réactionnel. Cette inhibition pourrait augmenter la spécificité du test mais cette démarche n’améliore que très marginalement les performances du diagnostic et reste peu utilisée.
Des tests rapides immunologiques sont également commercialisés (tableau L). Basés sur une immunofiltration sur gel ou sur une immunochromatographie sur membrane, ils ont
58
l’avantage d’apporter un résultat en moins d’une heure, avec une excellente valeur prédictive
négative (VPN) [122-124].
Plus récemment, une technologie par chimiluminescence a été développée sur automate de type Acustar ® (tableau 8).
Figure 8 : Automate Acustar
Ces tests utilisent des billes magnétiques sensibilisées par du FP4 modifié. La fixation des anticorps sur cette cible est détectée par chimiluminescence, à l’aide d’immunoconjugués polyvalents (G/A/M) ou spécifiques des IgG. Les performances de ces tests semblent comparables à celles des tests ELISA mais une analyse quantitative des résultats, comme celle
réalisée avec les tests ELISA, n’a jamais été publiée à ce jour [125]
.
La TIH peut ainsi être exclue chez tout patient avec un test immunologique négatif, grâce à sa forte valeur prédictive négative. Néanmoins, en raison de la valeur prédictive positive (VPP) insuffisante des tests immunologiques, en particulier après chirurgie
59
cardiaque, tout résultat positif doit être associé à la réalisation d’un test fonctionnel. La combinaison des deux types de tests permet ainsi de distinguer les anticorps pathogènes de ceux non-pathogènes, et améliore ainsi le diagnostic de TIH. Toutefois, en dehors de la chirurgie cardiaque, si la probabilité clinique (et donc pré-test) de TIH est élevée (avec un 4Ts 6), un test fortement positif (avec une DO > 2) pourrait suffire à confirmer le diagnostic
[121]
.
Tableau 8 : Tests immunologiques disponibles en France pour la détection des anticorps anti-FP4 modifiés [123].
60
2 Tests fonctionnels
Les tests fonctionnels mettent en évidence une activation plaquettaire induite par le plasma ou le sérum du patient en présence d’héparine. Ces tests, et plus particulièrement ceux réalisés en utilisant des plaquettes lavées, sont plus spécifiques que les tests immunologiques commercialisés puisqu’ils ne détectent que les anticorps activateurs des plaquettes en
présence d’héparine [126].
Les tests fonctionnels les plus performants sont le test de libération de sérotonine radiomarquée (SRA) et le test d’activation plaquettaire induite par l’héparine (HIPA), tous deux réalisés sur des plaquettes lavées. La sensibilité et la spécificité du SRA et du HIPA sont
supérieures à 95% [127] et la différence majeure entre ces deux tests est le stade d’activation
plaquettaire observé.
En effet, le test HIPA évalue l’agrégation plaquettaire tandis que le SRA mesure l’état d’activation des plaquettes en quantifiant la libération de sérotonine radiomarquée au carbone
14 après incubation des cellules avec l'échantillon du patient et l'héparine [128]
61
Figure 9 : Principe du test de libération de sérotonine radiomarquée
Le plasma riche en plaquettes (PRP) d’un sujet sain est incubé en présence de sérotonine radiomarquée au carbone 14 (14C-sérotonine). Les plaquettes lavées sont ensuite incubées avec le plasma du patient et
des concentrations croissantes d’héparine. En cas de TIH, les Ac anti-FP4/H du patient activent les plaquettes avec libération du contenu des granules denses dans le milieu extra-cellulaire. La radioactivité (R) mesurée dans le surnageant est proportionnelle à l’état d’activation plaquettaire. Les résultats sont exprimés en pourcentage de libération de sérotonine radiomarquée. Le résultat est considéré positif en cas de libération de sérotonine ≥ 20 % aux faibles concentrations d’héparine, avec une inhibition de la libération à forte concentration.
62
D’autres tests fonctionnels utilisent du plasma riche en plaquettes (test d’agrégation plaquettaire) ou du sang total (Multiplate®). Leur interprétation est parfois plus délicate car
ils sont moins sensibles, avec des faux négatifs [127]. D’autres tests fonctionnels mesurant la
libération d’ATP par lumi- agrégométrie, ou la formation de microparticules dérivées des
plaquettes par cytométrie en flux ont été développés mais pas validés [130.131]. De même, des
alternatives du SRA n’utilisant pas de radio-isotopes ont été proposées, et mesurent la sérotonine libérée par chromatographie liquide à haute performance, ou par cytométrie en flux
[132.133]. Quel que soit le test fonctionnel réalisé, des contrôles de qualité stricts sont requis : L’utilisation d’au moins 3 concentrations différentes d’héparine (0,01 à 1 et 10 à 100
UI/mL), afin de vérifier que l’activation plaquettaire est inhibée à forte concentration, Des contrôles positifs et négatifs dans chaque série,
L’utilisation de plusieurs donneurs de plaquettes ou la sélection de donneurs bons répondeurs avant de conclure à l’absence d’anticorps pathogènes car les plaquettes
répondent de manière très variable aux Ac de TIH [134]
.
Bien que le SRA et le HIPA soient généralement considérés comme les méthodes de référence ( gold standard ) pour le diagnostic de la TIH, ils ont plusieurs limites : ce sont des techniques longues, réalisables uniquement au sein de laboratoires spécialisés, et nécessitent une expertise lors de leur interprétation. De plus, le SRA est basé sur l’utilisation de radio-isotopes, ce qui implique de se conformer à la législation en vigueur, avec un agrément spécifique, des locaux sécurisés, et du personnel formé.