Tests comportementaux

Au cours de cette étude, 3 cohortes d’expériences comportementales ont été traitées de façon identique. Les souris KI mâles et femelles sont injectées avec le virus Cre ou contrôle dans l’APN. Après récupération post-opératoire (4 jours), elles sont placées à deux reprises pendant 2h sur les postes de comportement pour habituation. Lors de la seconde session d’habituation, les seuils de sensibilité sont mesurés pour habituer les animaux à être testés. Pendant les 4 semaines suivant les injections, 5 mesures basales (BL) de sensibilité mécanique (Von Frey) et thermique à la chaleur (Hargreaves) sont réalisées. Ce délai permet de dépasser le temps l’expression maximale théorique du virus (3 semaines) afin de garantir la stabilité des dernières mesures basales. A la suite celles-ci les ligatures du nerf sciatique sont pratiquées. Des mesures de Von Frey et Hargreaves sont ensuite effectuées pendant les 3 semaines de mise en place de la neuropathie (mesures SNI). La locomotion dynamique des animaux est évaluée avec le test du rotarod, à deux reprises au cours des mesures basales et une fois à la fin des mesures SNI. Enfin, la locomotion spontanée est évaluée avec le test du couloir circulaire à la fin des tests comportementaux. Les souris sont ensuite sacrifiées pour une localisation post-hoc des sites d’injection par immunohistochimie (cf. 21, Figure 21).

4.1. Test de Von Frey

La sensibilité mécanique des souris est mesurée par le test de Von Frey selon la méthode up-down (Chaplan et al., 1994). Les souris sont placées sur une grille surélevée (Ugo Basile) et le territoire de la voûte plantaire gauche, ipsilatérale à la lésion, innervée par la branche surale du nerf sciatique (Figure 20G), est stimulé à l’aide de filaments de Von Frey (Bioseb) de rigidités différentes. La force expérimentateur-dépendante appliquée par chaque filament est préalablement calibrée à l’aide d’une balance de précision (Tableau 4). Un premier filament exerçant une force théorique de 0.16g est utilisé. Si la souris montre une réaction à la stimulation (retrait de la patte ou écartement des doigts) un filament de force inférieure est appliqué. Sinon un filament de force supérieure est utilisé. Des stimulations séquentielles sont ainsi appliquées jusqu’à ce qu’un premier changement de réaction soit observé (positive puis négative ou inversement). 4 stimulations supplémentaires sont ensuite réalisées (excepté dans les cas où le filament de rigidité maximale ou minimale était utilisé). Ce protocole est répété 2 fois à 15min d’intervalle afin d’éviter toute sensibilisation. Le seuil de retrait de la patte (PWT : Paw Withdrawal Threshold)moyen calculé à partir de ces mesures correspond au

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103 poids nécessaire pour que la souris réagisse à la stimulation dans 50% des cas. Ces mesures sont réalisées 9 à 10 fois sur chaque cohorte.

Nous avons déterminé un pourcentage d’atténuation de l’allodynie à J+21, selon la formule suivante : % é = ^{/ − /} / Où / / = − / /

Sur 2 des 3 cohortes, un test de nage forcée a été effectué à la fin des expériences pour établir le niveau d’analgésie induit par le stress (stress induced analgesia). A la fin de la mesure SNI J+21, les souris sont placées pendant 3 à 5min dans une piscine d’eau à température ambiante, puis séchées et un nouveau test de Von Frey est effectué.

Figure 21 | Chronologie du paradigme expérimental mené sur les cohortes comportementales. BL : mesures basales

Force théorique (g) 0.02 0.04 0.07 0.16 0.4 0.6 1 1.4 Force réelle

moyenne (g) ^{0.028 0.048 0.749 0.166 0.430 0.623 1.032 1.353} SEM de la force

réelle (x 10^-3 g) ^{0.5 0.7 0.7 2.6 5 4.3 21.7 11.2}

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4.2. Test de Hargreaves

La sensibilité thermique à la chaleur des souris est déterminée à partir du test plantaire de Hargreaves. Les souris sont placées sur une plaque en verre et le territoire de la voûte plantaire gauche innervé par la branche surale du nerf sciatique lésé est stimulé à l’aide d’un générateur envoyant un faisceau de lumière infrarouge à 20% de puissance. Un système de détection de la réaction de la souris permet l’arrêt automatique de la source de chaleur et la mesure précise de la latence de réaction. 3 mesures sont réalisées par animal à 15min d’intervalles pour éviter toute sensibilisation. Ces mesures étaient réalisées 9 à 10 fois sur chaque cohorte.

4.3. Test du Rotarod

La coordination motrice des souris est évaluée par le test du rotarod (Bioseb). Les souris sont placées sur une barre rotative dont la vitesse est contrôlée avec une rampe d’accélération de 4 à 16 tours par minute pendant 3min. La durée de marche sur la barre avant la chute de l’animal est mesurée automatiquement, à trois reprises pour chaque jour de test. Ces mesures étaient réalisées 2 fois pendant les mesures de BL et une fois en fin de tests neuropathiques pour chaque cohorte.

4.4. Test du couloir circulaire

A la fin des différents protocoles effectués sur chaque cohorte, la locomotion spontanée des souris était évaluée par le test du couloir circulaire. Les souris sont placées dans un cyclotron (IMetronic) consistant en un couloir de PVC transparent de 10cm de largeur. Cette structure ne présentant ni centre aversif, ni coins préférentiels, et étant placée à l’obscurité, les souris se déplacent librement sans localisation anxiogène. Des capteurs placés dans 4 directions permettent la détection du nombre de quarts de tour effectués par les souris en 2 heures.

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4.5. Statistiques

Les analyses statistiques ont été effectuées avec le logiciel IGOR (Wavemetrics). Un test de Wilcoxon-Mann-Whitney (test U), pairé (comparaisons intra-groupe des mesures BL) ou non pairé (comparaisons groupe contrôle vs test) est effectué pour identifier les différences significatives. Pour le test de Von Frey et de Hargreaves, une correction de Bonferroni est appliquée pour la comparaison deux à deux des mesures basales ou SNI. Si aucune différence significative n’est détectée parmi les mesures basales, la distribution des valeurs SNI de chaque mesure est comparée à l’ensemble des valeurs basales. Les mesures de chaque point expérimental des groupes test et contrôle sont comparées deux à deux. Toutes les valeurs sont exprimées en moyenne ± SEM.

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