Test de rétention des protéines

Après l'assemblage de la puce, on évalue la rétention des protéines avec un test de filtration. Un échantillon de BSA (1 mg/mL) est chargé dans la puce et le volume sortant est recueilli. Si la puce est étanche, la solution passe obligatoirement à travers la membrane impliquant ainsi la rétention des protéines. Il est alors possible de récupérer les protéines retenues sur la membrane en faisant passer de l'eau Milli-Q dans le sens inverse de celui du chargement. Pour vérifier cela, la BSA est dosée dans la solution retenue lors du chargement, dans la solution percolée et collectée et dans l'échantillon avant chargement. Les dosages ont été effectués à l'aide d'un Nanodrop 1000 (ThermoFisher). Les résultats montrent que la rétention des protéines est effective car la solution filtrée présente une absorbance similaire au blanc (figure 22). Le dosage de la solution de récupération montre qu'environ 80% de la quantité de BSA chargée

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initialement dans la puce a pu être récupérée. La non récupération de l'intégralité de la solution chargée initialement peut être expliquée par la rétention non spécifique due à l'hydrophobicité du PDMS. Un traitement de la surface du PDMS pour la rendre hydrophile est donc nécessaire pour l'augmentation de la sensibilité de la méthode.

Figure 26 : Test de rétention de la BSA dans la puce (Dosage de la BSA dans un blanc, un échantillon d'1 mg/mL, une solution filtrée et la solution de récupération par percolation inverse) (Absorption UV à 280 nm

Des chambres de réactions de 3, 3.5 et 4 mm de diamètre ont été testées. Celles ayant 4 mm de diamètre ont été finalement sélectionnées car elles engendraient moins de résistance à l'écoulement.

5.2.5 Mise en œuvre du traitement de surface du PDMS

La surface du PDMS est hydrophobe par défaut. Ces propriétés hydrophobes entrainent une adsorption des protéines ou des peptides lors de l'analyse. La perte par adsorption d'une partie de l'échantillon est à prendre en considération pour les dispositifs dédiés à la protéomique d'une part parce que le phénomène est important dans le traitement des protéines mais aussi par ce que dans un dispositif miniaturisé le rapport surface/volume est très élevé.

Plusieurs approches de traitement du PDMS ont été testées durant l'élaboration du

ChipFilter. Les approches de traitement sur canaux fermés ont été privilégiés. En effet, le

traitement hydrophile du PDMS diminue considérablement ses capacités de collage. Or ces dernières sont d'une importance capitale dans l'intégration de la membrane de filtration moléculaire dans le ChipFilter.

Silanisation : Le protocole de traitement hydrophile sur canaux fermés le plus utilisé est la silanisation. Il consiste à placer la puce à traiter et un petit volume de silane (TriMethylChloroSilane)dans une enceinte fermée (boite de Petri). Le silane étant très volatile, s'évapore sature l'air et va ainsi pénétrer dans les canaux microfluidiques pour réagir avec la surface du PDMS. Ce protocole a été appliqué au ChipFilter mais les analyses comparatives entre puces traitées et non traitées n'ont pas donné de différences significatives. Ceci peut s'expliquer par le fait que la présence de la membrane gène la

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Blanc Echantillon Solution filtrée Récupération

Dosage de la BSA A b so rp ti on (A)

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circulation de l'air saturé en silane dans les chambres de réaction, ce qui réduit l'accès du silane à la surface du PDMS à l'intérieur du ChipFilter

Traitement en solution : Une alternative est la silanisation en solution. Le silane réagit avec l'eau, l'utilisation d'un solvant comme l'héxadecane reste donc la seule possibilité. L'application de ce protocole au ChipFilter n'a pas donné satisfaction car l'utilisation du solvant a entrainé une fragilisation des contacts autour de la membrane de filtration. Ce qui fragilise l'étanchéité de la puce et entraine une perte d'échantillon non négligeable lors du traitement sur puce.

Traitement en solution sans solvant : Le PDMS traité avec un plasma d'oxygène devient hydrophile mais de manière temporaire. Il retrouve son hydrophobicité au bout de quelques heures. Une manière de garder ce caractère hydrophile est de le faire réagir par mise en contact avec une solution de PVA (Poly Vinyl Alcohol) quelques minutes après l'exposition du PDMS au plasma. Cette approche peut être réalisée sur des canaux ouverts ou fermés. Le traitement sur canaux ouverts présente l'avantage de pouvoir être localisée. Ce protocole a été appliqué durant la fabrication du ChipFilter mais des difficultés à confiner la solution uniquement sur la surface des chambres de réaction sans toucher aux bords ont été rencontrées. En effet, la surface du PDMS au bord des chambres de réaction doit rester libre pour le collage et l'étanchéité de la puce.

Le traitement sur canaux fermés en utilisant le PVA entame l'étanchéité de la puce de manière significative car il doit être réalisé juste après le traitement du PDMS au plasma et la fermeture de la puce et l'étanchéité encore fragile dans ces moments est facilement compromise.

Le protocole qui a été retenu a consisté à utiliser le ChipFilter le plus rapidement possible après sa fabrication pour profiter de son hydrophilie acquise après le traitement au plasma d'oxygène. Ceci associé à un conditionnement avec une solution d'acide et de détergents (Béta_octyl).

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Chapitre 6 : Applications à l'identification des