Séparation et couplage à la spectrométrie de masse

Les unités de concentration peuvent avoir différents rôles dans une plateforme microfluidique pour l'analyse des protéines. Elles sont indispensables pour l'analyse des échantillons protéiques complexes. Elles peuvent être utilisées en amont de la digestion pour la purification et l'élimination de contaminants. En aval de la digestion, elles permettent de reconcentrer les peptides générés et de constituer une unité de séparation dans le cas de dispositifs directement couplés à la spectrométrie de masse. L'extraction sur phase solide (SPE) est peut-être l'approche la plus utilisée pour la concentration et la purification d'échantillon dans les dispositifs microfluidiques65. La phase solide peut être intégrée au dispositif microfluidique sous forme de particules89,90ou polymérisés directement9192 dans le microcanal. Ces particules sont généralement fonctionnalisées pour des interactions hydrophobes, échange d'ion... Des fonctionnalisations spécifiques peuvent être utilisées dans le but de cibler certaines modifications post-traductionnelles.

La configuration idéale et la plus adaptée à notre étude est un dispositif dont le design permettrait de purifier et concentrer l'échantillon avec un couplage à la spectrométrie de masse. En protéomique top-down, les dispositifs microfluidiques sont utilisés pour la purification et la séparation des protéines avant leur analyse en spectrométrie de masse. L'intégration de 2 membranes de microdialyse en sandwich dans une puce en polycarbonate présentée par Xiang et al. permet de supprimer les petites et grosses molécules indésirables par dialyse. Le dispositif couplé à la MS permet d'analyser les protéines directement93. Lion et al., ont utilisé une membrane ayant des propriétés hydrophobes, le PVDF, intégrée dans un dispositif microfluidique couplé à la MS pour le dessalage de protéines avant leur analyse directe94. Une séparation est par ailleurs nécessaire quand il s'agit d'échantillons complexes ou de peptides issus de la digestion d'une protéine. Les débits utilisés en microfluidique sont de l'ordre du µL/min et sont donc très adaptés à une source d'ionisation par électrospray. Certains dispositifs microfluidiques sont aussi adaptés aux sources MALDI. Plusieurs applications microfluidiques dotées d'une source ESI ont été développées et même commercialisées. L'ionisation par nano-électrospray est l'approche la plus prometteuse pour une interface robuste entre la microfluidique et la spectrométrie de masse. En effet, Agilent a commercialisé une puce microfluidique en polyimide dotée d'une unité de séparation en phase inverse et d'une source nanoESI intégrée. Ce système a permis l'analyse de peptides tryptiques de BSA avec des performances similaires à celles de la nanoLC classqiue95. Les puces microfluidiques fermées ne sont pas accessibles aux lasers pour une désorption

~ 66 ~

MALDI. La source MALDI est par ailleurs utilisée sur les systèmes miniaturisés à surface ouverte ou en encore sur les systèmes rotatifs96.

La protéomique bottom-up est un protocole d'analyse long et complexe qu'il serait avantageux de miniaturiser. Cependant, c'est cette complexité même qui rend sa miniaturisation délicate. L'intérêt de la miniaturisation de ce protocole se manifeste depuis plusieurs années par le développement de plusieurs dispositifs destinés à la protéomique.

Pour miniaturiser le protocole de protéomique bottom-up, il faudrait une plateforme microfluidique permettant une lyse cellulaire, la rétention des protéines pour les concentrer et les purifier, puis l'ajout de réactifs et le changement de tampon pour la réduction, l'alkylation et la digestion des protéines, ensuite une séparation et des peptides générés et enfin dotée d'une source pour une analyse directe en spectrométrie de masse. Il existe aujourd'hui différentes unités ayant permis de miniaturiser ces étapes mais pas une seule plateforme intégrant toutes ces unités. Quelques rares exceptions permettent de faire dans la même puce la concentration et la purification de l'échantillon, la réduction, l'alkylation des protéines et la digestion. Par ailleurs, la grande majorité des systèmes destinés à la miniaturisation de ces différentes étapes se limitent à des preuves de concept. En effet, ils se limitent souvent à une application sur un échantillon simple composé d'une seule protéine ou d'un mélange de 3 protéines standards.

~ 67 ~

Chapitre 5 : Design et fabrication d’un dispositif pour

la protéomique bottom-up

Comme annoncé dans le chapitre 1, une modification du protocole OcSILAC s'impose avant sa miniaturisation. C'est en effet la première étape de ce projet de thèse dont le but est de trouver une alternative à la précipitation des protéines. L'extraction des protéines est généralement suivie par des étapes ayant comme but d'éliminer certains composés indésirables présents dans l'échantillon. Il s'agit de sels et d'autres biomolécules inutiles et parfois indésirables pour la suite du protocole d'analyse des protéines. L'une des approches les plus utilisées consiste à provoquer la précipitation des protéines en ajoutant un acide comme le TCA. Une centrifugation permet de provoquer l'accumulation des protéines au fond du tube et l'élimination du surnageant contenant les composés indésirables comme les sels. L'ajout de solvant organique comme l'acétone renforce la précipitation par attraction électrostatique. En effet, l'acétone froid est utilisé pour éliminer le TCA après la précipitation des protéines. La précipitation acide des protéines (TCA) a été comparée à d'autres méthodes comme l'ultracentrifugation, la précipitation au chloroforme/méthanol au sulfate d'ammonium ou à l'acétone. Elle présente l'avantage d'être simple mais entraine des pertes d'échantillon visibles sur un gel 2D97.

Ce chapitre aborde les différentes initiatives entreprises pour trouver une alternative à la précipitation acide des protéines. Notre approche de départ, pour miniaturiser le protocole OcSILAC, consistait à trouver une phase solide sur laquelle les protéines pourraient être retenues pendant que le traitement chimique des protéines (Alkylation, réduction et marquage)est réalisé. Une rétention spécifique permettrait en effet que les réactifs en excès ainsi que les contaminants puissent être rincés rapidement sans entrainer de perte d'échantillon. Après le traitement chimique, les protéines sont digérées directement sur la phase solide. Les peptides générés sont ensuite élués et analysés en LC- MS/MS. Dans ce chapitre sont présentés les tests de rétention des protéines en utilisant les phases classiques d'extraction sur phase solide. Il aborde aussi l'adaptation du protocole OcSILAC sur Microcon avec la méthode FASP. Finalement, le choix avait été fait de concevoir un dispositif microfluidique intégrant une membrane de filtration moléculaire et inspiré de la méthode FASP. Les différentes étapes de fabrication de ce dispositif appelé Chipfilter sont détaillées dans ce chapitre.