Test de génotoxicité et de cytotoxicité

La totalité des tests de génotoxicité et de cytotoxicité ont été réalisés au laboratoire de Génie Chimique, à l’ENSAT, par Virginie Faucet-Marquis dans le cadre du projet TOXEAUBAM dont cette étude fait partie. Nous citons les résultats les plus importants concernant l’élimination de la toxicité liée au cyclophosphamide et à ses principaux métabolites. Les figures montrant les résultats sont présentées dans l’annexe 7. Il est intéressant de rapprocher le paramètre « toxicité » des résultats « épuratoires » du procédé bioréacteur à membrane. Malheureusement, nous ne sommes pas en mesure de fournir tous les résultats car, il reste encore des échantillons à analyser, surtout parmi ceux de la deuxième campagne expérimentale.

5.5.1 Tests de cytoxicité

L’évaluation de la cytotoxicité est réalisée par la mesure de la prolifération de cellules traitées par rapport au contrôle (cellules non traitées). La prolifération est mesurée quantitativement par le test colorimétrique au tétrazolium (dite méthode au MTT) et basée sur l’activité métabolique des cellules viables. Des tests de prolifération cellulaire ont été réalisés sur différentes lignées cellulaires telles que les cellules hépatiques humaines (HepG2) ou des cellules rénales humaines et animales. La lignée hépatique humaine HepG2 est la plus sensible aux effets des produits testés.

a. Test de cytotoxicité du Cyclophosphamide, de l’acroléine, de la moutarde phosphoramide et de la moutarde norazotée sur des cellules HePG2.

Après 24h de contact avec le CP (0,5µM) on note 20% de diminution de la viabilité et 40% après 48h de traitement. En ce qui concerne les métabolites réactifs du CP tels que l’acroléine (Acr), la

moutarde phosphoramide (MP) et la moutarde norazotée (MN), ils induisent une prolifération cellulaire importante dès les concentrations les plus faibles testées (0,05 µM).

Ainsi nous pouvons observer une modulation de la viabilité des cellules (mortalité accrue ou au contraire prolifération) par ces produits. De ce fait, le suivi des échantillons sortant du bioréacteur est néanmoins complexe parce que (a) les effets contraires engendrés par les substances mères et ses métabolites entraînent une ‘annulation’ des effets (b) la dilution nécessaire de l'échantillon dans le milieu de culture cellulaire rend ce test peu sensible.

b. Test de cytotoxicité du surnageant et du perméat des deux bioréacteurs sur des cellules HePG2. Campagne expérimentale I.

La viabilité cellulaire a été étudiée sur les perméats et les surnageants des deux bioréacteurs. Les résultats de la campagne I, montrent des effets de prolifération dans le surnageant du BAM R1 CP les jours 58, 60, 64, 108, 113, 131, et des effets cytotoxiques les jours, 141 et 145 de fonctionnement du pilote (Figure A7.1.1 annexe 7.).

Dans le perméat du BAM R1 CP, nous n’observons pas d’effet de prolifération. Les jours 53, 58, 69, 72 et 142, nous observons un très léger effet cytotoxique dans le perméat du BAM R1 CP (figure A7.1.2 annexe 7). En général, les valeurs de viabilité dans le perméat sont comparables au témoin.

c. Test de cytotoxicité de l’eau d’entrée, du surnageant et du perméat des deux bioréacteurs sur des cellules HePG2. Campagne expérimentale II.

L’analyse de la viabilité cellulaire des eaux d’entrée des bioréacteurs montre l’induction d’une forte prolifération cellulaire, celle-ci, étant comme on pouvait s’y attendre, plus importante lors de la présence du cocktail CP plus métabolites (Figures A7.3.1 et A7.3.2, annexe 7). Au niveau des perméats des deux bioréacteurs, on observe un retour à la normale avec des valeurs de viabilité comparables au témoin (figures A7.3.4 et A7.3.5 annexe 7). Dans le surnageant du BAM R1 CP, un très léger effet de prolifération est observé le jour 200 et un très léger effet cytotoxique est observé les jours 207 et 214 (figure A7.3.3, annexe 7)

5.5.2 Test de génotoxicité

Le test des « comètes » ou SCGE (Single Cell Gel Electrophoresis) est un test de génotoxicité, mesurant des lésions primaires de l'ADN. Il est très utilisé en écotoxicologie génétique, appliqué à

différentes espèces, il est très sensible pour le suivi et la recherche de toxicité de composés chimiques et de mélanges complexes.

Les échantillons du bioréacteur BAM R1 CP, dopé en cocktail de la 1ère _{campagne ont été}

analysés par le test des comètes. Nous observons des différences, en particulier, une augmentation de la génotoxicité pour plusieurs échantillons. Ces échantillons génotoxiques correspondent aux jours de fonctionnement 114-116, 134-136, 145, 152 et 156-157 du bioréacteur, ceci étant observé aussi bien sur les surnageants que sur les perméats (figure A7.2.1 et A7.2.2 annexe 7).

Relation toxicité – fonctionnement du BAM R1 CP

Dans le but d’établir un lien entre la cytotoxicité et la génotoxicité observé dans le surnageant du BAM R1 CP et le fonctionnement du bioréacteur, nous allons recalculer la toxicité mesurée comme la valeur absolue des écarts entre les valeurs de viabilité (mortalité ou prolifération) pour les tests de cytotoxicité par rapport au 100% de viabilité du témoin. Le même raisonnement est utilisé pour les valeurs de génotoxicité.

Les valeurs absolues des écarts entre les valeurs de viabilité (mortalité ou prolifération) dans le surnageant du BAM R1 CP par rapport au 100% de viabilité du témoin sont montrées sur la figure 5.4.2 (a) en fonction du temps, ainsi que l’évolution de la pression transmembranaire lors de la campagne expérimentale I. De la même façon, la figure 5.4.2 (b) présente l’évolution des écarts entre les valeurs de génotoxicité dans le surnageant du BAM R1 CP par rapport à la valeur témoin et celle de la pression transmembranaire en fonction du temps.

Il est intéressant de noter que, lors de la première campagne expérimentale, l’augmentation de la cyto/génotoxicité dans le surnageant est survenue aux alentours des jours au la pression transmembranaire augmente considérablement et pour certains jours, lorsque la pression transmembranaire diminue largement, la toxicité dans le perméat augmente à son tour de manière considérable.

De la même manière que dans la figure 5.4.2, la cytotoxicité et la géntoxicité dans le surnageant et dans le perméat BAM R1 CP sont présentées, ainsi que l’evolution de la concentration en substances humiques et en polysaccharides en fonction du temps dans la figure 5.4.3.