Test de composés sur le canal K AT P

7.1.2.1 Méthodologie adoptée

Douze composés, séparés en trois lots, dont l’effet avait été testé sur des artères de rats (mesure de la vasodilatation) nous ont été envoyés. Nous avons appliqué ses douze molécules sur des ovocytes exprimant SUR1 + Kir6.2 et SUR2A + Kir6.2 et mesuré les modifications induites en "patch–clamp" excisé "inside–out". Nous avons testé chaque composé à différentes concentrations (10 µM, 30 µM, 100 µM) en présence d’ATP à 100 µM, exceptés K0CN7 et K0CF7 pour cause d’instabilité à l’air. Le résumé des expériences est décrit dans le tableau 7.1.

Figure 7.1 – Effet du composé K0CF1 sur SUR1 + Kir6.2 et SUR2A + Kir6.2.(a.) Effet de K0CF1 sur SUR1 et SUR2A + Kir6.2 à 30 µM en présence de 100 µM ATP. "Contrôle" = 100 µM ATP avant application du composé, "Réversibilité"= 100 µM ATP après application du composé. ***, intervalle de confiance entre 97 et 100 %.(b.) Traces représentatives obtenues en "patch–clamp" excisé "inside–out". (c.) Courbe dose–réponse de K0CF1, l’ajustement correspond à l’équation de Hill la plus proche.

Les essais en présence et absence d’ATP permettent de mettre en évidence un effet activateur contrant l’inhibition induite par l’ATP. Quatre composés positifs sont ressortis de ce mini–criblage : K0CN1, K0CF1, PTC1–6Cl7Cl et PTC1–6Cl7F. Ces quatre molécules sont des ouvreurs spécifiques de SUR2A + Kir6.2 et SUR1 + Kir6.2.

K0CF1 à 30 µM, en présence d’ATP 100 µM, active spécifiquement SUR2A + Kir6.2 (30 % d’activation environ), de manière réversible et significative. La courbe dose–réponse effectuée nous donne une EC50 de 5,45 µM (fig. 7.1). Ce composé a

été testé en absence d’ATP et ne montre aucun effet sur SUR2A + Kir6.2 dans ces conditions (fig. 7.5). Cela signifie que K0CF1 agit sur SUR2A + Kir6.2 en réduisant l’inhibition par l’ATP. K0CN1 est le second composé identifié comme agissant sur SUR2A + Kir6.2 (activation autour de 40 % à 30 µM). Tout comme K0CF1, il s’agit d’un ouvreur dont l’effet est réversible. Si nous observons la courbe dose–réponse, nous remarquons qu’aux concentrations élevées, le palier n’est pas atteint. En effet, nous n’avons pas pu tester des concentrations plus élevées car nous avions atteint la limite de solubilité du composé. Nous pouvons cependant estimer que l’EC50se situe

aux alentours de 220 µM (fig. 7.2).

PTC1–6Cl7F est, quant à lui, actif sur le canal KAT P composé par SUR1 +

Kir6.2. L’ajout de ce composé à 30 µM induit une activation réversible d’environ 40 %. De plus, son application sur SUR2A + Kir6.2 ne provoque aucun changement significatif de courant, que ce soit en présence ou en absence d’ATP (fig. 7.5). La courbe dose–réponse présente le même profil que la précédente, nous n’avons pas pu obtenir de plateau dans les concentrations élevées et nous ne pouvons qu’estimer

Figure 7.2 – Effet du composé K0CN1 sur SUR1 + Kir6.2 et SUR2A + Kir6.2.(a.) Effet de K0CN1 sur SUR1 et SUR2A + Kir6.2 à 30 µM en présence de 100 µM ATP. "Contrôle" = 100 µM ATP avant application du composé, "Réversibilité"= 100 µM ATP après application du composé. ***, intervalle de confiance entre 97 et 100 %.(b.) Traces représentatives obtenues en "patch–clamp" excisé "inside–out". (c.) Courbe dose–réponse de K0CN1, l’ajustement correspond à l’équation de Hill la plus proche. Potentiel : -50 mV.

l’EC50comme se situant aux environs de 140 µM (fig. 7.3). PTC1–6Cl7Cl est égale-

ment un ouvreur spécifique de SUR1 + Kir6.2. L’activation d’environ 50 % induite par 30 µM PTC1–6Cl7Cl, en 100 µM ATP, est significative, mais irréversible. Le composé est donc bloqué dans son site de liaison et il est très difficile de l’en déloger par simple lavage, même prolongé. La courbe dose–réponse n’a pas pu être effectuée pour cause d’ovocytes de mauvaise qualité (fig. 7.4).

7.1.2.2 Discussion

Nous avons donc mis en évidence quatre composés ayant un effet positif sur SUR1 + Kir6.2 (PTC1–6Cl7Cl et PTC1–6Cl7F) et sur SUR2A + Kir6.2 (K0CN1 et K0CF1). Nous ne connaissons cependant pas les formules développées de ces mo- lécules puisqu’elles ne nous ont pas été fournies. Deux composés, K0CN7 et K0CF7 semblaient, d’après le Dr. Cecchetti avoir un certain potentiel. Néanmoins, leur insta- bilité à l’air en fait des produits difficiles à tester avec la technique de patch–clamp. Nous avons toutefois tenter de les tester, en préparant une solution en boîte à gants mais les résultats obtenus n’ont montré aucun effet probant sur SUR1 + Kir6.2 et SUR2A + Kir6.2. Nous avons donc abandonné les tests de ces composés. Les ouvreurs tels que K0CN1, K0CF1, PTC1–6Cl7F ou encore PTC1–6Cl7Cl, agissant spécifique- ment sur SUR2A + Kir6.2 ou SUR1 + Kir6.2 respectivement, peuvent constituer de futurs médicaments permettant de traiter des pathologies telles que l’hyperinsuliné- mie (SUR1 + Kir6.2). Le but était de trouver des composés ayant une forte affinité

Figure 7.3 – Effet du composé PTC1–6Cl7F sur SUR1 + Kir6.2 et SUR2A + Kir6.2.(a.) Effet de PTC1–6Cl7F sur SUR1 et SUR2A + Kir6.2 à 30 µM en présence de 100 µM ATP. "Contrôle" = 100 µM ATP avant application du composé, "Réversi- bilité"= 100 µM ATP après application du composé. ***, intervalle de confiance entre 97 et 100 %.(b.) Traces représentatives obtenues en "patch–clamp" excisé "inside– out". (c.) Courbe dose–réponse de PTC1–6Cl7F , l’ajustement correspond à l’équa- tion de Hill la plus proche. Potentiel : -50 mV.

Figure 7.4 – Effet du composé PTC1–6Cl7Cl sur SUR1 + Kir6.2 et SUR2A + Kir6.2.(a.) Effet de PTC1–6Cl7Cl sur SUR1 et SUR2A + Kir6.2 à 30 µM en présence de 100 µM ATP. "Contrôle" = 100 µM ATP avant application du composé, "Réversi- bilité"= 100 µM ATP après application du composé. ***, intervalle de confiance entre 97 et 100 %.(b.) Traces représentatives obtenues en patch–clamp excisé "inside–out". Potentiel : -50 mV.

Figure 7.5 – Effet des composés K0CN1 (a), K0CF1 (b), PTC1–6Cl7Cl (c), PTC1– 6Cl7F (d) sur SUR1 + Kir6.2 et SUR2A + Kir6.2 en 0 µM ATP. L’inhibition observée en (b), (c) et (d) est due au "run–down". Potentiel : -50 mV.

Lot Composés Testé à10, 30 et 100 µM Effet sur SUR1 + Kir6.2 en 100 µM ATP Effet sur SUR2A + Kir6.2 en 100 µM ATP Effet sur SUR1 + Kir6.2 en 0 µM ATP Effet sur SUR2A + Kir6.2 en 0 µM ATP Lot 1 K0CF1 Oui - +++ - - K0CF7* Non ∅ ∅ ∅ ∅ K0CN1 Oui - +++ - - K0CN7* Non ∅ ∅ ∅ ∅ K0Br3 Oui - - - -

Lot 2 K0Br3DK1Br3D OuiOui -- -- -- --

K2Br3D Oui - - - - Lot 3 PTC1–7Me Oui - - - - PTC1–7OMe Oui - - - - PTC1–6Cl7Cl Oui +++ - - - PTC1–6Cl7F Oui ++ - - -

Table 7.1 – Récapitulatif des composés testés. *L’instabilité à l’air de ces deux composés a rendu leur préparation et leur test difficiles.

pour le canal KAT P. Les EC50obtenues sont du même ordre que celles des ouvreurs

déjà existants (diazoxide : 140 µM sur SUR1, 76 µM sur SUR2A, pinacidil : 100 µM sur SUR2A + Kir6.2 [205]).