Le couple D3–Kir6.2

8.1.3.1 Construction du couple D3–Kir6.2

Tout comme pour l’élaboration des couples β2–Kir6.2, nous avons effectué l’ali-

gnement des séquences de M2, D2 et D3 afin de déterminer si D3 présentait une partie C–ter identique, plus courte ou plus longue que celles de M2 et D2. Il s’est avéré que D3 partage environ 50 % d’identité de séquence avec D2 et possède la même longueur C–ter que ce dernier. Ces deux récepteurs ne possèdent pas d’acides aminés supplémentaires après l’hélice H8 (cf. fig. 8.9). La similitude entre D2 et D3 est de bonne augure puisque cela suggère que le couple D3–Kir6.2 pourrait être fonctionnel sans modification de la taille du lien entre le GPCR et le canal. La construction de D3–K0-25 a été réalisée suivant le protocole décrit dans la section 4.2.3.

8.1.3.2 Expression de D3–K0-25

Une fois la protéine de fusion D3–K0-25 construite, nous l’avons exprimée dans l’ovocyte de xénope et avons mesuré les courants grâce à la méthode de double– microélectrodes. Le courant basal, comme expliqué précédemment, est un indicateur du niveau d’expression des canaux ioniques. Dans le cas de la fusion D3–K0-25 le courant de base mesuré est en moyenne de 0,43 µA ce qui correspond à un taux

Figure 8.9 – Alignement de la zone de fusion de M2–K0-25, D2–K0-25 et D3–K0-25.

Figure 8.10 – Courant basal de la construction D3–K0-25 seul ou en présence de TMD0. Potentiel : -50 mV.

d’expression moyen (fig. 8.10). Dans une optique d’amélioration, nous avons co– exprimé D3–K0-25 et TMD0 et le courant basal mesuré atteint une moyenne de 5,7 µA (fig. 8.10). TMD0 permet d’augmenter d’environ dix fois le courant basal de D3–K0-25, phénomène déjà observé avec les couples β2–Kir6.2.

8.1.3.3 Caractérisation de D3–K0-25

Afin de tester la fonctionnalité de D3–K0-25, nous avons utilisé la dopamine. L’ajout de cette dernière à 0,3 µM engendre une diminution du courant d’environ 17 % qui est réversible lorsque le ligand est retiré du milieu (fig. 8.11). Cependant, dans le cas de la fusion co–exprimée avec TMD0, l’application de dopamine 0,3 µM ne donne pas lieu à un changement significatif du courant mesuré (-3 %, fig. 8.11). Le comportement de D3–K0-25 est semblable à celui de D2–K0-25 puisque tous deux

Figure 8.11 – Test de fonctionnalité de D3–K0-25. (a) Traces représentatives obte- nues en double–microélectrodes. (b) Variation de courant induite par la dopamine à 0,3 µM. Potentiel : -50 mV.

engendrent une inhibition. Ces données pourraient nous apporter des informations quant au mécanisme de couplage entre les GPCR et Kir6.2, nous permettant de comprendre pourquoi le profil de la réponse diffère entre D2–K0-25, D3–K0-25 et M2–K0-25, β2–K0-25.

8.1.3.4 Fonctionnalité de D3 au sein de la fusion

Dans le but de déterminer si D3 est toujours fonctionnel (i.e. capable d’activer les protéines G) au sein de la fusion, nous utilisons un canal potassique rectifiant entrant activé par les protéines G (Kir3.x). En effet, les GPCR couplés aux protéines Gαi peuvent activer les canaux Kir3.x via les protéines Gβγ (fig. 8.12). Nous nous

servons donc de Kir3.x comme d’un rapporteur de l’activité des GPCR. Pour cela, D3–K0-25 et Kir3.x sont co–exprimés dans l’ovocyte de xénope. Cette approche est donc mise en œuvre dans le cas des GPCR couplés Gαi. En temps normal, Kir3.4 et

Kir3.1 s’associent pour former des hétérotétramères. Ainsi, Kir3.4* est muté (S143T) pour pouvoir être exprimé sans Kir3.1 [319].

L’application de dopamine à 1 µM sur D3–K0-25 + Kir3.4* semble provoquer une légère activation qui est bien inférieure à celles mesurées habituellement avec

Figure 8.12 – Principe du contrôle de fonctionnalité de D3 au sein de la fusion. (1.) Le ligand se fixe sur le GPCR. (2.) Le GPCR est activé et stimule par la suite les protéines G. (3.) Les protéines G induisent l’ouverture du canal potassique Kir3.x. Les canaux Kir6.2 et Kir3.x sont bloqués par le Ba2+_.

Figure 8.13 – Contrôle de fonctionnalité de D3 au sein de la fusion D3–K0-25. Traces représentatives obtenues par la technique de double–microélectrodes. Potentiel : -50 mV.

d’autres GPCR. L’effet observé résulterait en fait de la somme de l’inhibition de D3–K0-25 et de l’activation de Kir3.4*. En outre, en guise de contrôle, nous avons suivi l’effet de l’activation de D3, non fusionné à Kir6.2, sur le courant engendré par Kir3.4*. L’ajout de dopamine 0,3 µM a pour conséquence une ouverture de Kir3.4* (fig. 8.13). Ces données n’étant pas suffisamment convaincantes, nous ne pouvons pas vraiment conclure quant à la fonctionnalité de D3 lorsqu’il est fusionné à Kir6.2.

8.1.3.5 Discussion

Les résultats obtenus avec la fusion D3–K0-25 sont très encourageants mais res- tent relativement préliminaires. Pour l’instant, les données montrent que le récepteur dopaminergique D3, lorsqu’il est fusionné à Kir6.2 délété de 25 résidus en N–ter est capable d’inhiber l’activité du canal en réponse à la dopamine. Ceci est très intéres- sant mécanistiquement parlant étant donné que D2 et D3 partagent environ 50 % d’identité. Les deux récepteurs ont également la même longueur en C–ter. Ces élé- ments suggèrent que la longueur du lien entre le GPCR et le canal joue un rôle dans le

Figure 8.14 – Alignement de la zone de fusion de M2–K0-25, D2–K0-25 et CB1– Kir6.2.

sens (activation ou inhibition) de la réponse engendrée par la stimulation du GPCR. De plus, il a été montré que lorsque le récepteur M2 est raccourci de neuf résidus, atteignant ainsi la taille de D2, le profil de la réponse est inversé [Moreau et al., en préparation]. De la même manière, l’ajout des neuf résidus C–terminaux de M2 en C–ter de D2 fusionné à Kir6.2 permet de modifier le sens de la réponse induite suite à l’ajout de dopamine [Moreau et al., en préparation]. Un effet surprenant est celui de la co–expression de D3–K0-25 et TMD0 qui augmente très efficacement (dix fois) le courant basal mais abolit l’effet induit par l’activation de D3. Ce phénomène avait déjà été observé avec le couple D2–K0-25. TMD0 étant connu pour augmenter la P0

de Kir6.2 [20, 81, 46] et également l’expression de surface, nous pouvons supposer que l’abolition de l’inhibition résulte de la somme de ces deux effets. En effet, il est tout à fait plausible que le fait d’avoir plus de canaux à la Po élevée à la membrane atténue

fortement cette inhibition. Enfin, des expériences complémentaires sont en cours ou à faire : doses–réponse de dopamine afin d’évaluer la sensibilité de D3–K0-25, test de U–99194(antagoniste), reproduire les mesures effectuées avec Kir3.4*. . .