Test des comètes alcalin avec FPG

Pour ce protocole, on procède de la même manière que pour le protocole du test des comètes alcalin jusqu'à l'étape de la lyse. Après celle-ci, les lames destinées au traitement avec FPG sont rincées brièvement 2 fois dans l'eau distillée (les autres lames demeurent dans la solution de lyse). Les lames sont ensuite rincées 5 minutes dans le tampon enzymatique (40 mM Hepes, 0,5 mM Na2EDTA, 0,1 M KCI). L'excès de liquide

est enlevé, puis 30 pi de solution de FPG (New England Biolabs) 1/1000 (avec BSA 2mg/ml, dans du tampon enzymatique) est déposé sur chacun des deux disques des lames. Celles-ci sont par la suite incubées 30 minutes à 37°C, puis le protocole se poursuit avec le déroulement. À partir de cette étape et jusqu'à la fin le protocole est identique au protocole d'essai comète alcalin décrit dans la sous-section précédente.

Les deux expériences ont été faites en simultané sur 19 jours. Chaque série analytique comprenait un témoin provenant de la lignée lymphoblastique humaine GM00131. Des aliquots de ces cellules ont été congelés dans les mêmes conditions que les cellules des participants et soumis aux mêmes traitements au cours de l'expérience. La moyenne du dommage de ces cellules est de 1,0% et le coefficient de variation inter-jour est de 40% (n=19).

3.3 Résultats

Le dommage basai à l'ADN lymphocytaire a été mesuré par l'essai comète alcalin. Ce test permet de détecter les cassures simple brin et double brin, les sites abasiques ainsi que les sites alcali-labiles. Le traitement au FPG devrait de plus révéler le dommage oxydatif en convertissant en cassures à l'ADN pouvant être révélé lors de l'essai comète les endroits sur l'ADN où l'on retrouve des bases oxydées. Rappelons que les cassures à l'ADN sont induites par un agent génotoxique (l'acrylamide par exemple), par des enzymes de réparation ou suite à la fragmentation de l'ADN lors de Tapoptose.

Le paramètre choisi pour représenter les résultats est le pourcentage d'ADN dans la queue de la comète, qui reflète la proportion de TADN ayant subi des cassures. Celles-ci engendrent des fragments d'ADN plus ou moins longs selon la fréquence des cassures et la distance entre celles-ci. Plus un fragment sera court, plus il migrera dans le champ électrophorétique. À l'inverse, dans une cellule où TADN a subi aucune ou très peu de cassures, TADN ne migrera pas en raison de la taille du ou des fragments et au microscope la comète sera ronde car toute TADN se trouve dans la tête. Le pourcentage d'ADN dans la queue a ainsi été mesuré pour chacun des 130 échantillons réalisés en duplicata. Notons que les cellules ayant plus de 75% d'ADN dans la queue, aussi appelés «hedgehogs», n'ont pas été comptabilisées lors du calcul de la moyenne du dommage basai, mais entrent en compte dans le calcul du pourcentage de cellules endommagées. Les cellules ont été classés en deux catégories, soit endommagés (pourcentage moyen d'ADN dans la queue supérieur à 1%) et non endommagés (pourcentage moyen d'ADN dans la queue inférieur à 1 %).

Les résultats présentés dans le tableau 8 montrent un dommage basai faible sur TADN lymphocytaire des participants. Pour le test des comètes sans FPG, la moyenne géométrique du dommage basai est de 1,1%, avec des résultats variant entre 0,4 et 3,8%. Le pourcentage de cellules endommagées est de 18,1 % et les résultats varient de 7,5 à 54,0%. Pour ce qui est du test des comètes avec FPG, on se serait attendu à ce que les résultats soient supérieurs à ceux de l'essai comète sans FPG étant donné que le traitement est supposé révéler certains bris sur TADN indétectables par l'essai comète alcalin seul. Cependant, les résultats sont plutôt légèrement inférieurs : une moyenne de dommage basai de 0,8% avec des résultats variant entre 0,2 et 4,1% et un pourcentage de cellules endommagées de 16,5 % avec des résultats variant entre 5,5 et 51,5%. Ces résultats suggèrent une absence de dommage oxydatif à TADN.

Tableau 8. Dommage à l'ADN lymphocytaire mesuré par le test des comètes" Moyenne

géo. Min. -

(IC 95%) Max. Centiles

10e 25e 50e 75e 90e

Sans FPG 95e 1,1(1,0- 0,4- %ADN queue 1,2) 3,8 0,6 0,8 1,1 1,6 2,2 2,6 % cellules 18,1 (17,0 7,5- endommagéesb -19,2) 54,0 11,0 14,5 18,3 22,0 28,5 35,5 Avec FPG 0,8 (0,7 %ADN queue 0,9) 0,2- 4,1 0,4 0,6 0,8 1,2 1,7 2,3 % cellules 16,5(15,4 5,5- endommagées" -17,7) 51,5 9,5 13,3 17,0 21,5 28,0 30,0

a Le test a été réalisé chez 130 participants; pour les autres participants (35), le nombre de

lymphocytes viables après décongélation était insuffisant pour effectuer le test.

b Pourcentage des 200 cellules montrant un dommage (%ADN queue) supérieur à 1%.

Le coefficient de corrélation de rangs de Spearman a été utilisé pour tester la relation entre le pourcentage de dommage à TADN lymphocytaire et les concentrations de biomarqueurs urinaires, ainsi qu'entre le dommage et les concentrations d'adduits à l'hémoglobine AAVal et GAVal. La somme des metabolites NACP et NACP-S a été utilisée pour représenter la concentration des metabolites urinaires. Ce résultat ainsi que la somme des adduits à l'hémoglobine peuvent être assimilés à l'apport alimentaire en AA à des fins de comparaison avec le dommage à TADN lymphocytaire. Le tableau 9 présente les résultats de ces tests. Dans aucun cas le dommage à TADN n'est corrélé aux concentrations des biomarqueurs de l'AA. Finalement, le dommage à TADN lymphocytaire n'augmente pas de concert avec l'exposition à l'acrylamide, tel que mesuré indirectement par la somme des metabolites urinaires NACP et NACP-S (r de Spearman = 0,14, p =

0,13) ou par la somme des adduits à l'hémoglobine AAVal et GAVal (r de Spearman = 0,02, p = 0,84). La faiblesse des coefficients de Spearman semble être du à un manque de puissance statistique causé par un échantillon trop restreint. Toutefois, on note une tendance dans le cas de la somme de NACP et NACP-S (p = 0,13).

Tableau 9. Corrélations de Spearman entre le dommage à l'ADN et les biomarqueurs d'exposition à l'acrylamide Traitement Donnée Somme de NACP et NACP-S (pmol/mol de creatinine) Somme de AAVal et GAVal (pmol/g globine) Sans FPG (n=130) % Dommage (valeur p) 0,135 (0,127) -0,021 (0,812) Sans FPG (n=130) _{% cellules} endommagées (valeur p) 0,107 (0,227) -0,018 (0,839) Avec FPG (n=129) % Dommage (valeur p) (0,117) -0,139 -0,184 (0,038) Avec FPG (n=129) _{% cellules} endommagées (valeur p) -0,119 (0,181) -0,196 (0,027)