La détermination du temps d’attente (7), résulte de la comparaison des concentrations résiduelles présentes dans l’organisme aux limites maximales de résidus (ou des concentrations du marqueur à la tolérance). En Europe, le temps d’attente est défini comme étant la limite supérieure de l’intervalle de tolérance à 95% dans laquelle les teneurs résiduelles tissulaires soient inférieures aux LMR avec un intervalle de confiance de 95%. En d’autres termes, le temps d’attente est défini par une probabilité caractérisant un risque (5%) d’avoir 5% des animaux dont les teneurs résiduelles tissulaires soient supérieures à la LMR. Ce temps d’attente est proposé par l’industriel et est validé par au cours de la procédure d’autorisation de mise sur le marché pour des indications précises et pour une posologie définie (dose, durée d’administration) chez une espèce. L’allongement du traitement n’est pas, en règle générale (sauf accumulation) de nature à allonger le temps d’attente. En revanche, l’augmentation des doses allonge le temps d’attente parce que les concentrations de principes actifs sont plus élevées dans l’organisme. Mais il n’est pas possible de dire de combien sans connaître la vitesse d’élimination des résidus.
Ln C (en µg/g) -1 0 1 2 3 Temps (jours) 1 2 3 Ln LMR Temps D’attente
a) Lignes directrices
La détermination du temps d’attente (7) se fait selon les principes de la pharmacocinétique compartimentale. La relation entre la concentration et le temps durant toutes les phases d’absorption, de distribution et d’élimination est décrite par une équation multi-exponentielle. Cependant la phase terminale d’élimination, dans la plupart des cas suit un modèle log- linéaire et est suffisamment bien décrite par un seul terme exponentiel. L’équation de cinétique du premier ordre pour cette phase d’élimination est :
Ct = C0 e-kt équation 1.1.
Où Ct est la concentration au temps t, C0 est la concentration extrapolée au temps t = 0 et k est la vitesse d’élimination.
La linéarité de la relation lnC=f(t) indique que ce modèle de déplétion tissulaire est applicable et que l’analyse de régression des données transformées peut être utilisée pour le calcul du temps d’attente. Pour éviter un biais dans le calcul de la pente et de l’ordonnée à l’origine, chaque point de la droite de régression doit provenir du même nombre de répétition de mesure. L’effet de l’erreur analytique sur le résultat final est négligeable en comparaison avec la variabilité interindividuelle.
Tandis que la Food and Drug Administration (FDA) recommande d’exclure les données sous la limite de quantification, l’agence européenne (EMEA) considère que cette approche biaise la droite de régression et qu’étant donné que ces observations existent, elles doivent être prises en considération. Il est alors recommandé de remplacer ces valeurs par la moitié de la valeur de la limite de quantification. Des approches alternatives ont été décrites par Helsel (109)et Newman (169). Un minimum de 3 animaux à un minimum de 3 temps d’abattage est requis pour l’analyse de régression. Si il n’y a pas 3 points valides pour un temps d’abattage il faut exclure ce point de l’analyse. Les lignes directrices préconisent pour répondre aux hypothèses sous-tendues par une analyse par régression linéaire de vérifier:
- l’indépendance des données (mesures sur animaux différents)
- l’homogénéité des variances sur les données (concentrations ayant subies une transformation logarithmique) pour chaque jour d’abattage.
- le logarithme des concentrations en fonction du temps doivent décrire une fonction monotone
- la distribution gaussienne des erreurs à chaque échéance
Le temps d’attente est déterminé lorsque la limite supérieure de l’intervalle de tolérance à un seuil de confiance fixé se trouve sous la LMR. Si ce temps ne correspond pas à un jour entier, le temps d’attente est arrondi au jour supérieur. Selon Stange (218), à l’aide de la droite de régression, une estimation de la proportion 1-γ de la population (au seuil 1-α) qui se trouve sous la limite supérieure de tolérance est calculée comme décrit dans la figure 1.8.
Une méthode plus simple, consiste à déclarer le temps d’attente comme le temps nécessaire à ce que les résidus dans tous les tissus de tous les animaux observés descendent en dessous des LMR respectives. Cette approche se veut pragmatique et présente donc deux avantages : elle ne requiert pas d’hypothèse contraignante sur la population à partir de laquelle on a obtenu les données comme c’est le cas dans l’approche de régression et elle peut être menée selon un
schéma expérimental séquentiel : un certain nombre d’animaux sont abattus au même temps; si aucune des observations ne se situe au dessus de la LMR, le temps d’abattage est déclaré comme étant le temps d’attente, sinon un autre groupe est abattu après un temps plus long jusqu’à ce qu’il n’y ait plus une observation au dessus de la LMR
Cette dernière manière de procéder présente deux inconvénients :
- la détermination rapide et réitérée des concentrations résiduelles dans les tissus n’est pas toujours analytiquement possible,
- elle est inacceptable en terme d’inférence statistique car elle ne possède aucune définition qui permette de documenter la confiance que l’on peut avoir dans l’estimation du temps d’attente.
b) Observations sur l’approche de régression préconisée
Au début des années 90, des modèles statistiques destinés à la détermination des temps d’attente ont été comparés en utilisant des données simulées (11). Les estimations des temps d’attente obtenues à partir d’échantillons de grandes tailles issus de populations à paramètres connus ont été comparées avec les résultats obtenus par analyse de régression de données de petits échantillons issus de la même population. Dans ce contexte, l’hypothèse testée est que les logarithmes de la teneur en résidu sont distribués normalement et que la décroissance est linéaire sur une échelle semi-logarithmique. Les délais d’attente ont été déterminés comme étant le temps correspondant à la limite supérieure de l’intervalle de confiance (pour un risque donné) qui permet d’être en dessous de la DJA. A partir de ces résultats simulés, il est conclu que des temps d’attente adéquats, mais non nécessairement précis, peuvent être déterminés à partir d’un petit nombre de données cinétiques.
Cependant il existe plusieurs hypothèses à vérifier lorsque l’on utilise la méthode de régression linéaire pour estimer des paramètres, qui ne sont pas forcément toutes respectées en appliquant les lignes directrices européennes.
i) Il ne doit y avoir aucune incertitude sur le temps d’abattage
ii) Une simple inspection visuelle des concentrations sur une échelle logarithmique en fonction du temps permet de vérifier la linéarité mais le fait que la phase terminale soit influencée par les phases précédentes et ne soit pratiquement jamais isolable soulève le problème du nombre relatif de termes exponentiels et la possibilité d’estimer la « droite utile » sans biais (79). La possibilité d’une décroissance multiexponentielle devrait être prise en compte lors de la mise en place de l’essai et si nécessaire il faudrait utiliser des modèles mono, bi ou tri exponentiels selon le cas. La conséquence sous-jacente à cela est que la limite de quantification de la méthode analytique devrait se situer le plus en dessous possible de la LMR.
iii) L’hypothèse de normalité de la distribution du logarithme des concentrations à chaque temps d’abattage doit aussi être vérifiée. A la différence de l’estimation de paramètres moyens pour lesquels le théorème central limite peut être utilisé, l’estimation du temps d’attente qui implique un faible pourcentage (1%) de la distribution normale doit répondre à cette hypothèse. Il n’y a que deux moyens de résoudre ce problème :
o avoir suffisamment de données pour modéliser la distribution des concentrations et en déduire la LMR à partir de cette distribution
o utiliser une approche non-paramétrique qui n’implique pas d’hypothèse quant à la distribution associée à notre échantillon
iv) L’approche de régression suppose qu’après transformation logarithmique, la variance des concentrations ne varie pas en fonction des temps d’abattage. Cependant cette hypothèse ne peut pas être vérifiée étant donnée la variabilité biologique résultant d’une décroissance exponentielle
v) Si toutes les concentrations sont obtenues chez différents animaux, en utilisant une méthode analytique appropriée, la dernière condition concernant l’indépendance des observations ne posera pas problème. Cependant il faut garder à l’esprit que cette dernière n’est pas remplie lorsque l’on réalise une série de mesures à des temps différents sur le même animal.
Des simulations (56) ont permis de démontrer qu’un légèr écart à une de ces hypothèses menait à une estimation incorrecte du temps d’attente. De plus les tests préconisés ne sont pas assez puissants pour mettre en évidence une incompatibilité des données avec les hypothèses utilisées pour les analyses de régression linéaire. Enfin, il a été souligné que les hypothèses d’homoscédasticité et de linéarité ne sont pas en accord avec les processus physiologiques déterminant le comportement de la molécule. C’est pourquoi les mêmes auteurs (57) ont proposé une nouvelle approche non-paramétrique pour la détermination du temps d’attente avant abattage.
Bien qu’une diversification des méthodes statistiques dans la détermination du temps d’attente ait été préconisée (87), c’est toujours la méthode paramétrique de régression linéaire qui est retrouvée dans les lignes directrices européennes et américaines. Plusieurs raisons (152) ont été invoquées pour cela :
- augmenter le nombre d’animaux pour conserver le pouvoir statistique en utilisant des tests non-paramétriques doublerait le coût des études.
- il a été proposé aux autorités réglementaires d’utiliser un plus grand pourcentage de la distribution pour estimer le temps d’attente, c’est-à-dire de prendre moins de précautions plutôt que de faire une estimation erronée du temps d’attente, ce qui semble inacceptable du point de vue de l’administration afin de conserver la confiance du consommateur.
- Les autorités désirent une méthode qui permette de changer le temps d’ attente si des nouvelles informations sur la tolérance interviennent ce que permet l’approche paramétrique sans nouvelle étude à la différence de l’approche non paramétrique.
c)
Temps d’attente avant abattage des volailles traitées au monensin et à la salinomycine Etant donné que la méthode analytique ne permet pas de suivre la décroissance des concentrations en monensin dans les tissus au delà du premier jour et en considérant la variabilité interindividuelle qui représente 50% des valeurs moyennes retenues pour le calcul, il a été décidé de conserver une certaine marge de sécurité en établissant un temps d’attente de 3 jours chez le poulet et le dindon, délai au bout duquel l’exposition du consommateur sera inférieure à 50% de la DJA. De même compte tenu des limites de la méthode analytique en matière de quantification, un temps d’attente d’une journée a été jugé suffisant chez le poulet pour la salinomycine.Tractus digestif TOP PO IV IM SC Foie Foie Reins Biotransformation Bile Urine Réabsorption tubulaire Sécrétions Fécès Site d’action Site de toxicité Tissus
Liaison aux tissus Circulation systémique
Liaison aux protéines Circulation
Epiderme Liaison aux derme
Figure 1.9. Mécanismes d’ADME et modes d’administration des médicaments (198) A = absorption, D = distribution, M = métabolisme, E = excrétion.
A A E E E E M M D D