Excepté pour les cancérogènes génotoxiques pour lesquels il est considèré qu’il existe un risque à toutes les doses, il est définit pour chaque molécule une dose sans effet (DSE ou NOEL pour No Observed Effect Level) comme étant la dose maximale de substance qui, ingérée quotidiennement durant toute sa vie et chez l'animal le plus sensible, n'entraîne aucun effet négatif dans les conditions actuelles des connaissances. Elle s'exprime en mg de substance par kilo de poids vif et par jour. La détermination de la DSE dans une étude expérimentale chez l’animal dépend en premier lieu des doses sélectionnées de manière à ce que la plus forte dose produise un effet toxique tandis que la plus faible dose n’en provoque pas.
La pharmacocinétique et le métabolisme des produits doivent être testés, notamment in vitro (116), pour déterminer si les profils différent selon les niveaux d’exposition auxquels l’homme est confronté. Si des différences significatives sont observées, un plus grand nombre de doses doit être étudié. Des non linéarité d’un point de vue métabolique compliquent les extrapolations de l’animal à l’homme. Ces données peuvent donc influencer le choix de l’espèce la plus sensible dans la détermination de la DSE.
Résidus totaux Résidu marqueur 0 5 10 Jours post-dose 15 20 25 30 0 10 20 Résidus (µg equi /g) Concentration de sécurité Tolérance
La plus petite dose sans effet identifiée à partir des études toxicologiques (9) pour le monensin est de 1,2 mg/kg/j calculée sur la base d’un essai de toxicité chronique de 2 ans chez la souris. Cependant des effets cardiovasculaires prononcés observés à cette dose chez le chien ont conduit à choisir une DSE pour le monensin de 0,345 mg/kg/j. Pour la salinomycine (10), la dose sans effet de 0,5 mg/kg/j a été obtenue en se fondant sur une étude de toxicité orale à 12 mois chez le chien.
b) Etudes de métabolisme, marqueur et tissu cible
- Etude pilote sur l’animal de laboratoire : Lorsqu’il y a peu ou pas d’information disponible sur le métabolisme du principe actif chez l’animal de laboratoire (celui utilisé pour les études de toxicité chronique, par exemple le rat) et chez l’animal de destination, il est prudent de réaliser des études pilotes dans les deux espèces. Les objectifs de cette étude préliminaire sont de démontrer la stabilité métabolique de la molécule marquée, de déterminer le recouvrement de la radioactivité et de développer des méthodes analytiques valides pour isoler et identifier les métabolites.
- Développement analytique : Des méthodes analytiques doivent être développées et validées par l’industriel pour étudier la relation entre la déplétion des résidus totaux (mesurés par la radioactivité) et le résidu marqueur dans les tissus. L’industriel doit également proposer des méthodes analytiques de dépistage, de quantification et d’identification qui pourront être utilisées pour la surveillance et le contrôle des résidus.
- Etude pilote sur l’animal de destination : L’étude de déplétion des résidus totaux permet d’identifier le tissu cible pour lequel la cinétique des résidus est la plus longue et de définir le résidu marqueur, c’est-à-dire celui qui est le mieux correlé avec les résidus totaux. L’analyse des données permet d’établir un ratio résidu marqueur sur résidus totaux. A partir de cette étude pilote, il est également possible de déterminer plus précisément les intervalles de sacrifice à réaliser lors de l’étude principale et de s’assurer que la radioactivité à la dernière échéance sera suffisante pour isoler et identifier les métabolites majeurs.
- Etude de métabolisme : L’objectif de cette étude est de définir la déplétion de l’ensemble des résidus dans les tissus d’intérêt pour l’espèce cible après administration de la molécule. La molécule marquée avec une forte pureté (>98%) doit être utilisée pour étudier la distribution et la déplétion de la radioactivité. Les échantillons de tissus et d’excrétas sont tout d’abord analysés afin de recueillir la radioactivité puis extraits et analysés par chromatographie pour identifier les métabolites avec les méthodes développées lors des études pilotes. Ces données sont utilisées pour confirmer le tissu cible et le marqueur chez un nombre suffisant d’animaux ainsi que pour confirmer l’identité des métabolites tissulaires, fécaux et urinaires. Toutes ces données seront utilisées pour définir la relation entre les résidus totaux et le marqueur dans le tissu cible chez un nombre suffisant d’animaux recevant la dose maximale recommandée. Cette relation (ratio marqueur/résidus totaux en fonction du temps) sera utilisée pour interpréter les résultats de l’étude de déplétion finale (figure 1.7.).
L’animal de laboratoire sélectionné se voit administrer une dose répétée de molécule marquée pendant un temps suffisamment long pour s’assurer que le composé a subit tous les évènements métaboliques incluant induction et inhibition enzymatique. Si les métabolites observés dans les tissus de l’animal cible le sont aussi dans les excrétas de l’animal de laboratoire, alors l’industriel a démontré un métabolisme comparable. Sinon, les tissus de l’animal de laboratoire doivent également être analysés pour démontrer un métabolisme comparable chez les deux espèces.
- Etude de déplétion finale : L’objectif de cette étude est d’établir la déplétion du résidu marqueur dans les tissus chez les animaux traités durant la dernière phase de déplétion proche de la limite maximale de résidus. Cela permettra par la suite de calculer un temps d’attente. Le schéma expérimental doit être le plus proche possible des conditions d’utilisation de la molécule sur le terrain.