A-Principe de la microscopie confocale à balayage laser
Les microscopes optiques conventionnels sont limités par l’émission de la
fluorescence des structures situées en dehors du plan focal ce qui dégrade l’image (Erie et coll., 2009). La technique d’imagerie confocale a été décrite pour la première fois par Minsky en 1957. Le principe est de pratiquer des coupes optiques virtuelles de l’objet observé et de n’enregistrer que l’image de fluorescence émise dans le plan en éliminant les signaux
provenant de régions situés en dehors du plan focal. Elle permet d’obtenir des images de grande résolution à différents niveaux de l’épaisseur d’un échantillon, ce qui donne accès à
des informations situées à l’intérieur de l’échantillon.
Figure 35. Schéma illustrant le fonctionnement de la microscopie confocale à balayage laser (modifié d’après Paddock, 2009).
Un rayon laser excitateur (source de lumière) va pénétrer dans l’échantillon qui a été
auparavant marqué par un ou plusieurs fluorochromes (Figure 35). Des rayons lumineux vont donc être émis par les différents plans de la préparation et être transmis vers le photo-détecteur grâce à un miroir dichroïque. Les rayons réfléchis sont filtrés en fonction de leur
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d’épingle, il est possible de sélectionner uniquement les rayons émis par le plan focal. Seuls
les rayons issus du plan focal sélectionné peuvent arriver dans le détecteur. Les rayons issus des régions situées au-dessus ou en-dessous du plan focal ne passe par la diaphragme et ne
sont donc pas représenté sur l’image obtenue grâce à la conversion du signal lumineux en
signal numérique (Erie et coll., 2009 ; Paddock, 2000 ; Tovey et coll., 2005).
B- Les anticorps
B-1 Les anticorps primaires
L’anticorps (Ac) primaire utilisé pour marquer la sous-unité DmNav1.1 est l’anticorps
anti-SP19 (Alomone Labs, Jérusalem, Israël) obtenu à partir de lapin immunisés avec le peptide SP19 (French et coll., 1993). Ce peptide correspond aux résidus 1501 à 1518 situés dans le linker 3 du canal Nav de type I chez le rat. Cet anticorps reconnaît le canal Nav au niveau de plusieurs tissus de vertébrés et d’invertébrés tels que le cerveau, le muscle squelettique et le cœur chez le rat, le cerveau chez l’anguille et le système nerveux central
chez le criquet, la blatte, la sauterelle, la mouche et le papillon de nuit (Amat et coll., 1998).
L’anticorps utilisé pour identifier les sous-unités auxiliaires est l’anticorps RGS-His (Quiagen, Valencia, Californie, USA) qui est obtenu chez la souris. Cet anticorps reconnaît le
tag histidine RGSHHHH qui a été inséré à l’extrémité N-terminale de chaque sous-unité auxiliaire.
B-2 Les anticorps secondaires
Les anticorps secondaires utilisés sont des immunoglobulines G de chèvre conjuguées à un Alexa Fluor® (InvitrogenTM). L’anticorps secondaire qui permet l’identification de la
sous-unité principale DmNav1-1 est anti-lapin et est couplé à l’Alexa Fluor® 488. Celui qui permet l’identification de la sous-unité auxiliaire PaTEH1A ou PaTEH1B est anti-souris et est
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C-Immunomarquage des ovocytes de xénope exprimant les canaux
Na
vC-1 Conditions à tester
Tout d’abord, il est indispensable de réaliser un certain nombre de contrôles pour vérifier que la fluorescence observée est bien spécifique des deux sous-unités. Les différents contrôles effectués sont les suivants :
- Ovocytes injectés en absence d’anticorps pour identifier l’auto-fluorescence des sous-unités dans la membrane des ovocytes. Ce contrôle a été fait pour les ovocytes injectés
avec de l’eau, avec DmNav1-1/PaTEH1A et DmNav1-1/PaTEH1B.
- Ovocytes injectés avec de l’eau en présence des anticorps primaires et secondaires pour vérifier que le signal observé est bien spécifique des sous-unités du canal Nav. - Ovocytes injectés avec DmNav1-1 et PaTEH1A en présence de l’un ou l’autre des
anticorps primaires (anti-SP19 ou anti-RGS) pour mesurer l’auto-fluorescence des anticorps primaires
- Ovocytes injectés avec DmNav1-1 et PaTEH1A en présence de l’un ou l’autre des
anticorps secondaires (immunoglobulines G de chèvre anti-lapin conjugués à l’Alexa
Fluor® 546 ou immunoglobulines G de chèvre anti-souris conjugués à l’Alexa Fluor®
488) pour vérifier leurs spécificités.
- Ovocytes injectés avec DmNav1-1 et PaTEH1A en croisant les anticorps primaires et secondaires pour vérifier leurs spécificités.
C-2 Protocole de marquage des ovocytes
Une centaine d’ovocytes albinos a été injectée avec environ 3 ng d’ARN de DmNav
1-1 et de l’une ou l’autre des sous-unités auxiliaires, à savoir PaTEH1A ou PaTEH1B présentant un tag histidine (RGSHHHH).
Cinq jours après injection et après vérification de l’expression de canaux Nav par la technique de la double micro électrode, les ovocytes ont été rincés dans une solution de PB à 0,09 M. Puis, ils ont été fixés pendant 30 min à 4°C dans une solution de paraformaldéhyde à 2%, préparée dans du PB à 0,09 M. Les ovocytes ont ensuite été rincés par 3 lavages de 5 min chacun dans du PB 0,09 M suivi de 3 lavages de 5 min chacun dans du PBS 1X. Les ovocytes ont ensuite été perméabilisés dans du PBS-Triton 0,2% additionné de gélatine de poisson à 0,25% pendant 1h (3 incubations de 20 minutes chacune). Le Triton va permettre la
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perméabilisation de la membrane pour faciliter l’entrée des anticorps dans l’ovocyte. La gélatine de poisson permet d’éviter une fixation non-spécifique des anticorps primaires en se fixant sur les sites non spécifiques. Les ovocytes ont alors été incubés avec les anticorps primaires toute la nuit à 4°C :
- Ac anti SP19 dilué au 1/100ème dans du PBS-T 0,2% additionné de gélatine de poisson à 0,25%
- Ac anti RGS-His dilué au 1/500ème dans du PBS-T 0,2% additionné de gélatine de poisson à 0,25%
Après incubation avec les anticorps primaires les ovocytes ont été rincés par 3 lavages de 5 min chacun dans du PBS-T 0,2% additionné de gélatine de poisson à 0,25%. Ils ont ensuite été incubés avec les anticorps secondaires pendant 1h30 min à température ambiante :
- Immunoglobulines G de chèvre anti-lapin conjugués à l’Alexa Fluor® 546
(Invitrogen) dilué au 1/3000ème dans du PBS-T 0,2% additionné de gélatine de poisson à 0,25%
- Immunoglobulines G de chèvre anti-souris conjuguées à l’Alexa Fluor®
488 (Invitrogen) dilué au 1/3000ème dans du PBS-T 0,2% additionné de gélatine de poisson à 0,25%
Après incubation les ovocytes ont été rincés par 3 lavages de 5 min chacun dans du
PBS 1X et recouverts d’une solution de PBS/glycérol 20% filtrée.
Le microscope confocal à balayage laser utilisé est un Nikon A1S1 (Nikon
Instruments, Melville, NY) équipé d’un laser argon à 488 nm et d’une diode à 561 nm. Les ovocytes ont été observés grâce à l’objectif 10x avec une ouverture numérique de 0,3 mm.
L’Alexa® 488 a été excité à 488 nm et la fluorescence émise a été collectée en utilisant un
filtre allant de 500 à 550 nm tandis que l’Alexa® 546 a été excité à 561 nm et la fluorescence émise a été récupérée grâce à un filtre allant de 570 à 600 nm.
Les images obtenues ont ensuite été analysées avec le logiciel Image J (version 1.4.3.67).
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