Mise en évidence de la rétention d’intron à l’origine du variant PaTEH1B

PaTEH1B

Les variants PaTEH1A et PaTEH1B ont une origine qui peut s’expliquer par plusieurs mécanismes. Premièrement, ils peuvent résulter de l’épissage alternatif d’un même gène. La

séquence de 94 pb s’insérant à l’extrémité 3’ de la séquence nucléique peut être un exon épissé alternativement ou il peut s’agir d’un intron qui a été retenu lors de la maturation des ARNm. Deuxièmement, ces deux variants résultent de l’expression de deux gènes distincts. Le gène codant la sous-unité PaTEH1 aurait subi une duplication dans le génome de P.

americana.

Pour vérifier notre première hypothèse, nous avons réalisé une amplification du gène

PaTEH1 sur l’ADNg avec les amorces ciblant le cadre ouvert de lecture. L’électrophorèse des produits d’amplification a révélé la présence de deux bandes à environ 900 et 1300 pb

(Figure 40A). La bande observée à environ 900 pb semble être de la même taille que la bande

supérieure obtenue suite à l’amplification réalisée sur l’ADNc (Figure 40B).

Figure 40. Electrophorèse des produits PCR obtenus en utilisant l’ADNg ou l’ADNc comme matrice. A. La PCR réalisée avec les amorces ciblant le cadre ouvert de lecture sur l’ADNg conduit à l’amplification de deux amplicons d’environ 900 pb et 1300 pb. B. La PCR réalisée avec les amorces ciblant le cadre ouvert de lecture sur l’ADNc conduit à l’amplification de deux amplicons d’environ 850 et 900 pb.

Le clonage et le séquençage des amplicons montrent que la séquence de 900 pb amplifiée à partir de l’ADN génomique est parfaitement identique à celle du variant PaTEH1B. En revanche, la séquence d’environ 1300 pb ne contient pas de séquence codante

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de PaTEH1, elle résulte donc d’une amplification non spécifique. Par rapport aux ADNc clonés coodant la sous-unité PaTEH1A, les amplicons de 900 pb contiennent une séquence supplémentaire de 94 pb. L’analyse de cette séquence montre que celle-ci présente toutes les

caractéristiques d’un intron (Cartegni et coll., 2002). En effet, cette séquence de 94 pb est

bornée par un site donneur d’épissage et un site accepteur d’épissage (Figure 41A). Le

dinucléotide présent en 5’ est conforme au site donneur consensus (GT) induisant l’épissage. En revanche, la séquence nucléotidique observée en 3’ (tttttgtgctgtg) diffère légèrement du site accepteur consensus (yyyyyyyynyag¹¹). En effet, ce site est dit faible de par la présence de trois purines (aux positions -3, -6 et -8) et par son dinucléotide terminal TG au lieu de AG (Bourinet et coll., 1999 ; Szafranski et coll., 2007). La protéine PaTEH1B est donc formée par

l’exon 1 et une partie de l’intron (Figure 41B).

Figure 41. Origine des variants PaTEH1A et PaTEH1B.

A. Le gène codant la sous-unité PaTEH1 est constitué de deux exons (de 806 et 37 pb), et d’un intron de 94 pb dont la séquence est en lettres minuscules. Le site donneur d’épissage, le site accepteur d’épissage et le site de branchement sont soulignés. Le codon de terminaison (TAG) présent dans l’intron est en lettres majuscules. B. Séquences nucléiques et protéiques des régions C-terminales des deux protéines codées par le gène Pateh1. La protéine PaTEH1A est codée par les exons 1 et 2 alors que la protéine PaTEH1B est codée par l’exon 1 et une partie de l’intron.

11 Y : pyrimidine (T ou C), N : nucléotide aléatoire (A, T, C ou G)

Exon 2 (37 pb) Intron (94 pb)

Site donneur

d’épissage 5’ ^{Site accepteur} d’épissage 3’

806 pb Exon 1 * codon stop Site de branchement 100bp A B PaTEH1A (280 aa) GATGCCAGAGTCGCATTGTTGGACTGTGAAGAAGATAGAACATGA D A R V A L L D C E E D R T *

…

…

…

…

…

(279 aa)

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Pour évaluer notre deuxième hypothèse (deux gènes distincts), nous avons réalisé une

hybridation par Southern blot. L’ADNg de la blatte P. americana, préalablement digéré par

une enzyme de restriction (EcoRI ou KpnI), a été séparé par électrophorèse sur gel d’agarose. La sonde utilisée pour s’hybrider sur le (ou les) gène(s) codant la sous-unité TEH1 a été choisie dans une région commune à PaTEH1A et PaTEH1B (voir Matériels et Méthodes,

Figure 30). Premièrement, les signaux spécifiques observés sur les pistes 3 et 4 (Figure 42) nous indiquent que la sonde utilisée se fixe bien sur l’ADN de la sous-unité PaTEH1. Deuxièmement, un signal spécifique est observé sur la piste 1 alors que deux signaux sont observés sur la piste 2 (Figure 42). Ces résultats sont contradictoires. En effet, les résultats

obtenus sur la piste 1 suggèrent qu’il n’y a qu’un seul gène qui code les sous-unités PaTEH1A et PaTEH1B. A contrario, les résultats observés sur la piste 2 suggèrent que deux gènes pourraient chacun coder un variant.

Figure 42. Résultats d’hybridation Southern à partir d’ADNg de P. americana. Les signaux spécifiques sont indiqués par des flèches

noires. Piste 1 : ADNg digéré par l’endonucléase EcoRI (10 µg), piste 2 : ADNg digéré par l’endonucléase KpnI (10 µg), piste 3 : témoin positif (10 ng), piste 4 : témoin positif (10 pg) ; taille des ADN témoin : 4000 pb. En présence de l’enzyme de restriction EcoRI, un seul signal est observé. En présence de l’enzyme de restriction KpnI, deux signaux sont observés. Les pistes 3 et 4 permettent de contrôler la fixation de la sonde sur l’ADN cible (expériences réalisées par Benoit CALMES et Thomas GUILLEMETTE, Equipe Fungisem, IRHS).

Dans l’hypothèse où il y aurait deux gènes, il est possible que l’enzyme EcoRI ait

libéré des fragments de même taille (environ 4500 pb), indissociables sur le gel d’agarose. Pour confirmer les résultats obtenus, il faudrait envisager de digérer l’ADNg avec d’autres

endonucléases. Par ailleurs, les signaux observés sont relativement faibles, ce qui est

probablement dû à une quantité d’ADNg trop faible. Pour confirmer ce résultat, il serait nécessaire de refaire une hybridation Southern en augmentant la quantité d’ADNg. Pour ces expériences nous avions digéré 10 µg d’ADNg. A la vue des résultats obtenus, une quantité de 20 µg serait plus adéquate.

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