Clonage des différents produits PCR obtenus

F-1 Principe général du clonage

Le clonage de l’ADN est une technique de biologie moléculaire qui permet l’isolement d’une séquence d’ADN spécifique dans un vecteur. L’opération consiste à introduire un fragment d’ADN d’intérêt dans un vecteur ou un plasmide. L’insertion de l’ADN dans le

vecteur va reposer sur l’utilisation de plusieurs techniques de biologie moléculaire qui vont

permettre la recombinaison in vitro de l’ADN. Les plasmides ou vecteurs sont des molécules d’ADN circulaire qui permettent d’introduire l’ADN d’intérêt dans l’organisme hôte (ici ce sera la bactérie Escherichia coli). Ils assurent aussi le maintien de l’ADN d’intérêt dans la

cellule hôte au cours des divisions cellulaires.

Cette technique permet d’une part, de réaliser des constructions dans des vecteurs d’expression et d’autre part de produire des molécules d’ADN recombinant et de les

introduire dans des organismes hôtes pour permettre leur réplication.

F-2 Les vecteurs utilisés

Dans cette étude, deux vecteurs ont été utilisés. Le vecteur de clonage pCR^®4 TOPO^® (Invitrogen^TM) a été utilisé pour le clonage des ADN partiels, des produits PCR obtenus en 5’ et 3’ RACE et des transcrits complets. Le vecteur d’expression pGEM a été utilisé pour le

clonage des ORF.

F-2-1 Le vecteur de clonage pCR^®4 TOPO^®

Le vecteur plasmidique pCR^®4 TOPO^® (Figure 26) est fourni sous forme linéaire. Il

possède une topoisomérase lié au vecteur de façon covalente et des extrémités 3’cohésives se

terminant par une thymidine pour faciliter le clonage TA (méthode du « TA cloning »). Les produits PCR qui ont été insérés dans ce vecteur ont été obtenus en utilisant des polymérases

ayant une activité terminale transférase qui permet l’ajout de désoxyadénosines aux extrémités 3’ des amplicons. Les inserts ainsi obtenus vont se lier au vecteur grâce à une

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Figure 26. Carte de restriction du vecteur pCR^®4-TOPO^®(modifié d’après InvitrogenTM ).

Remarque : Les transcrits complets des sous-unités PaTEH2 et PaTEH3 ont été amplifiés avec une enzyme qui ne posséde pas d’activité terminale transférase. Pour réaliser l’insertion

de ces transcrits dans le vecteur pCR^®4 TOPO^® des désoxyadénosines ont été ajoutées aux

extrémités 3’ après la PCR.

F-2-2 Le vecteur d’expression pGEM-HEJUEL

Les produits PCR correspondant aux transcrits codant le cadre de lecture des

sous-unités auxiliaires ont été clonés dans le plasmide d’expression pGEM HEJUEL (don du Pr

Olaf Pongs, Institut de Transduction du Signal Neuronal, Hambourg, Allemagne) par la technique du clonage directionnel. Cette technique consiste à liguer l’insert au plasmide au

niveau de sites de restriction compatibles.

Le vecteur pGEM HEJUEL est un vecteur conçu pour la transcription in vitro d’ARN

(Figure 27). Il contient le promoteur T7 pour la transcription des ADNc clonés et les

séquences 5’ et 3’ non codantes de la β-globine du xénope Xenopus laevis situées de part et

d’autre du site de polyclonage. Ces séquences permettent de stabiliser les ARNm injectés

dans les ovocytes.

201 CACACAGGAA ACAGCTATGA CCATGATTAC GCCAAGCTCA GAATTAACCC TCACTAAAGG GTGTGTCCTT TGTCGATACT GGTACTAATG CGGTTCGAGT CTTAATTGGG AGTGATTTCC

261 GACTAGTCCT GCAGGTTTAA ACGAATTCGC CCTT AGGGC GAATTCGCGG CTGATCAGGA CGTCCAAATT TGCTTAAGCG GGA TTCCCG CTTAAGCGCC

311 CCGCTAAATT CAATTCGCCC TATAGTGAGT CGTATTACAA TTCACTGGCC GTCGTTTTAC GGCGATTTAA GTTAAGCGGG ATATCACTCA GCATAATGTT AAGTGACCGG CAGCAAAATG

insert ^A

A

M13R T3

SpeI PstI EcoRI EcoRI NotI

M13F T7

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Figure 27. Carte de restriction du vecteur pGEM-HEJUEL.

1: Promoteur T7, 2: 5’UTR β-globine de xénope, 3: 3’UTR β-globine de xénope, 4: Promoteur Ampicilline, 5: gène de résistance à l’ampicilline.

F-2-2-1 Préparation du vecteur pGEM-HEJUEL

Pour pouvoir recevoir l’insert, le vecteur pGEM-HEJUEL a été digéré par les endonucléases XmaI et XbaI⁸. Ces endonucléases ont été choisies car les sites qu’elles

reconnaissent sont rares et ne sont pas présents dans les inserts. Le vecteur a donc été digéré à 37°C par les endonucléases XmaI (Promega) et XbaI (Invitrogen) dans un tampon compatible avec les deux enzymes (Tampon B (Promega) : 60 mM deTris-Hcl, 60 mM de MgCl2, 500 mM de NaCl, 10 mM de DTT, pH=7,5). Les enzymes de restriction ont ensuite été inactivées à 65°C pendant 15 minutes. Le plasmide doublement digéré présente alors des extrémités

cohésives. Afin d’éviter qu’il ne se re-circularise lors de la ligation de l’insert les extrémités 5’ du vecteur ont été déphosphorylées avec la phosphatase alkaline d’intestin de veau (CIAP). Le vecteur ainsi digéré et déphosphorylé a été purifié avec le kit NucleoSpin^® Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel) comme indiqué dans le paragraphe E-2-1.

8 Les séquences des sites reconnus par les endonucléases sont CCCGGG (XmaI) et TCTAGA (XbaI).

1 ₂ 4 3 5 XmaI EcoRI XbaI NotI SpeI KpnI 3000 1500 pGEM-HEJUEL 3047pb

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F-2-2-2 Clonage directionnel des transcrits codant les cadres ouverts de lecture des sous-unités auxiliaires

Les données de séquençage obtenues suite à l’amplification des extrémités 5’ et 3’ des

séquences des différentes sous-unités auxiliaires et des transcrits amplifiés avec des amorces ciblant les régions non codantes, ont permis de dessiner des amorces spécifiques des cadres ouverts de lecture de chaque sous-unité auxiliaire. Pour pouvoir insérer ces transcrits dans le vecteur pGEM-HEJUEL, les séquences des endonucléases XmaI et XbaI ont été ajoutés à

l’extrémité de la séquences des amorces (Tableau 15).

Tableau 15 : Amorces spécifiques utilisées pour amplifier les ORF des sous-unités auxiliaires de P.americana

Sous-unité

Nom des

amorces ^{Séquences nucléotidiques}

Taille de la région amplifiée TipE TP_17S 5’-aaacccgggccaaccATGGAcGAGCCGGAGATTGAGC-3’ 1065 et 1191pb TP_18R 5’-caaaatctagaTCAGACTTCCGCTATCGGCCCAG-3’ TP_64R 5’-TTACTTGGGTCTCCAGGAGATGTT-3’ TEH2 TP_58S 5’-aaacccgggccaccATGGGTGCCGAGGGGGGCGGA-3’ 690 et 732pb TP_59R 5’-caaaatctagaTTACTCTTCCTTGGTGGGGTATTT-3’ TP_63R 5’-caaaatctagactTCAGTGTTCAGTACTCTTCCTC-3’ TEH3 ^TP_44S 5’-aaacccgggccaccATGCCCAAACAAAAGCCGATCCC-3’ 1368pb TP_45R 5’-caaaatctagaTCAGAGCGCCATAACCGAGTCTCC-3’

Les régions soulignées et en italique correspondent aux sites de restriction des enzymes XmaI et XbaI. Pour ne pas avoir deux codons d’initiation (ATG) successifs dans la séquence de PaTipE le nucléotide "T" du deuxième codon a été remplacé par un "c", dans l’amorce TP_17S. En effet, la présence de deux ATG successifs pourrait engendrer des erreurs lors de la transcription in vitro (Chapitre 3, paragraphe D). Cette mutation ne modifie ni le cadre lecture, ni la séquence protéique.

Pour les amplifications des cadres ouverts de lecture de chaque sous-unité auxiliaire, nous avons réalisé une PCR emboitée : la matrice utilisée pour la PCR correspond au produit de la PCR1 réalisée avec les amorces ciblant les régions non codantes (paragraphe D-4). En effet les amorces répertoriées dans le tableau 15 sont des amorces internes par rapport aux amorces du tableau 14 qui sont dites amorces externes.

Pour la sous-unité auxiliaire TipE, la polymérase utilisée est l’Advantage. 1 µl de la PCR1 diluée au 1/10^ème a été utilisé en présence des amorces TP_17S et TP_18R (Tableau

15). Le cycle de température utilisé est le suivant : 95°C 1 min, 30*[95°C 30 s, 68°C 3 min],

68°C 3 min. Les résultats obtenus après séquençage montrant de grandes variations, une deuxième PCR a été réalisée avec la polymérase KOD avec 1 µl de la PCR1 diluée au 1/100^ème. Le cycle de température utilisé est le suivant : 95°C 2 min, 30*[95°C 20 s, 68°C 10 s, 70°C 20 s], 70°C 1 min.

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Pour la sous-unité TEH2, deux couples d’amorces ont également été utilisés : TP_58S et TP_59R, et TP_58S et TP_63R (Tableau 15). Les deux PCR ont été réalisées avec la polymérase KOD, en utilisant 1µl de PCR 1 diluée au 1/10^ème, avec le cycle de température suivant : 95°C 2min, 30*[95°C 20s, 64°C 15s, 70°C 15s], 70°C 15s.

L’amplification de l’ORF de la sous-unité PaTEH3 a été réalisée avec les amorces TP_44S et TP_45R (Tableau 15) avec la polymérase KOD et 1µl de matrice diluée au 1/10^ème. Le cycle de température utilisé est le suivant : 95°C 2 min, 30*[95°C 20s, 68°C 10s, 70°C 40s], 70°C 40s.

Les produits PCR correspondant aux cadres ouverts de lecture ont été digérés par les endonucléases XmaI et XbaI puis ont été purifiés avec le kit NucleoSpin^® Gel and PCR Clean-up. La ligation a alors été réalisée en mettant en présence des inserts et du plasmide digérés par XmaI et XbaI (proportion 3:1⁹) en présence d’une ligase (T4 DNA Ligase,

Invitrogen) et du tampon approprié (250 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 50 mM de MgCl2, 5 mM d’ATP, 5 mM de DTT et 25% de polyéthylène glycol). Les produits de ligation ont ensuite été conservés à 4°C jusqu’à la transformation bactérienne.

F-3 La transformation bactérienne

La transfection est un processus qui permet l’introduction d’un ADN exogène dans des

cellules. Lorsque les cellules sont des bactéries, ce processus est nommé transformation bactérienne. La cellule hôte utilisée dans ce travail est la bactérie Escherichia coli. Celle-ci a été rendu chimio-compétente par un traitement chimique qui a fragilisé sa membrane (Cellules chimio-compétentes DG1, Delphi Genetics/Eurogentec, Belgique). L’entrée de l’ADN dans la bactérie se fait par choc thermique.

2 à 5 µl de produit de ligation ont été placés dans un tube décongelé de bactéries (50 µl). Après une incubation de 10 à 20 min à 4°C, un choc thermique a été appliqué aux bactéries. Le tube a été placé dans un bain marie à 42°C pendant 30s puis aussitôt remis dans la glace pendant 2 min. Du milieu de culture (250 µl de SOC (2% tryptone, 0,5% extrait de levure, 10 mM chlorure de sodium 2,5 mM cholrure de potassium, 10 mM chlorure de magnesium), Delphi Genetics/Eurogentec) est ajouté aux bactéries pour permettre leur multiplication à 37°C pendant 1h. Cette étape se fait sous agitation (250 rpm) en plaçant le

tube horizontalement pour augmenter la surface d’échange. Après cette incubation, les

9 Les quantités ont été calculées grâce à la formule suivante :

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bactéries sont étalées sur un milieu de culture solide coulé dans des boîtes de Pétri et incubées pendant 14 -16h à 37°C. Le milieu de culture utilisé est un milieu LB (2% de Lennox Both

Base (Invitrogen™), 1,5% d’agar (Invitrogen™) et 1% d’extrait de levure (Bacto™ Yeast

Extract, Becton, Dickinson and Company, Lept de Claix, France)). Ce milieu a été

supplémenté avec de l’ampicilline (100 µg/ml) ce qui permet uniquement la croissance des

bactéries qui ont intégré le plasmide.

Pour les bactéries transformées avec le vecteur pCR^®4 TOPO^®, 40 µl d’une solution d’X-Gal dilué dans du diméthylformamide (40 mg/ml) ont préalablement été étalé sur le milieu LB. Le vecteur pCR^®4 TOPO^® est porteur du gène lacZα-ccdB (codant la β -galactosidase). L’insert s’intègre au niveau du site de polyclonage situé entre le promoteur

LacZ et la séquence codante de la betaGal. Si l’insert est présent, le gène ne sera plus exprimé

et la réaction d’hydrolyse de l’X-Gal par la β-galactosidase n’aura pas lieu. Par conséquent, les bactéries recombinantes qui ont intégré le vecteur contenant l’insert seront translucides (betagal^-) alors que les autres seront bleues (betagal⁺).