Techniques de mesure de la perte d’azote endogène

Selon l’expression de la digestibilité, il existe différentes techniques de mesure des pertes endogènes (basale et totale), comme l’indique le tableau 1-3.

Tableau 1-3 Détermination des flux iléaux endogènes en azote et en lysine chez les

porcs en croissance en utilisant différentes méthodes

Méthodes L’apport en protéines alimentaires l’azote et de lysine Flux endogènes de Références Azote Lysine g-1_{/100g ration μg/g MSI} Protéiprives - 0 1556 286 Chung et Baker., 1992 - 0 1834 354 Mariscal-Landin et al., 1995 - 0 1500 252 Butt et al., 1993 - 0 1860 570 Leterme et al., 1996c

- 0 1610 407 Leterme et al., 1996a

- 0 1410 310 Hess et al.. 1998

- 0 1753 - Hodgkinson et al., 2000

- 0 1980 390 Hess et al., 2000

- 0 1600 310 Zhang etal., 2002

Protéiprives + infusion i.v. des AA

- 0 2032 560 de Lange et al., 1989 a

- 0 1840 457 Leterme et al. 1996 b

Régression

Isolat de soja 6-17 1428 382 Mariscal-Landin et al., 1995

Tourteau de soja 4-24 2640 470 Fan et al., 1995

AA Alimentaire dépourvu de Lys

AA libre 8 - 284 Butts et al., 1993a

Peptide alimentation/Ultrafiltration

caséine hydrolysée 10 3700 448 Butts et al., 1993

caséine hydrolysée 10 2851 456 Hodgkinson et al., 2000 caséine hydrolysée 10 1543 287 Hodgkinson et al., 2003

caséine hydrolysée 11 1817 - Leterme et al., 1996 a

caséine hydrolysée 15 2270 280 Morel et al., 2003

caséine hydrolysée 18 1490 320 Steendam et al., 2004 a

caséine hydrolysée 20 3940 880 Yin et al.,2004

Protéines hautement digestibles

Caséine 5 3110 680 Zhang et al., 2002

Caséine 8 2528 221 Mariscal-Landin et al., 2006

Caséine 10 2273 384 Chung et Baker., 1992

Caséine 10 2760 295 Mariscal-Landin et al., 2006

Homoarginine

Caséine 8 1520 320 Libao-Mercado et al., 2006

Caséine 10 1179 214 Hodgkinson etal., 2003

Caséine 15 4728 - Roos et al., 1994

Caséine 20 2304 490 Yin et., 2004

Caséine 21 1160 586 Nyachoti et al., 1997 a

dilution isotopique Infusion 15_N-Ieucine

caséine hydrolysée 18 1950 - Steendam et al., 2004 a

isolat de soja 18 2740 - Schulze et al., 1995 b

isolat de pois 18 2113 - Hess et al., 2000

15_{N alimentaire}

caséine hydrolysée 10 1011 - Hodgkinson et al., 2003

Technique d’estimation des pertes basales Technique des rations protéiprives

C’est une méthode directe peu coûteuse couramment utilisée pour déterminer le flux endogène basal de protéine et des AAs. Elle consiste à soumettre les animaux à des rations dépourvues de protéines afin de doser les quantités des différents composés azotés recueillis dans les fèces ou le digesta iléal ainsi toute la protéine et tous les AAs récupérés sont d’origine endogène (Adeola et al., 1986). Cependant, dans le cas d’un régime protéiprive, les quantités sécrétées peuvent être inférieures à celles obtenues en présence d’une source de protéines alimentaires (Moughan et al., 1992; Butts et al., 1993; Leterme et al., 1996a; Moughan et al., 2005). Néanmoins, Bastianelli (1996) note une grande variabilité des valeurs d’excrétion endogène d’azote obtenues selon cette technique (2,34±0,96 g N/kg MSI). De plus, une alimentation dépourvue de protéines a été critiquée en raison de son caractère non physiologique. En effet, en plaçant les animaux en bilan protéique négatif, cela conduirait à une sous-estimation des pertes azotées endogènes (Low, 1980), excepté pour la glycine et la proline (Stein, 1999). L’excrétion importante de proline consécutive à l’ingestion d’un aliment protéiprive (Hodgkinson et Moughan, 2000) ou d’un aliment à faible teneur en protéines (Mariscal- Landin et De Souza, 2006) traduit bien une perturbation du métabolisme azoté de l’animal. Ce surplus de proline excrétée s’explique soit par une mobilisation des réserves azotées corporelles, notamment musculaires (de Lange et al., 1989a). En effet, une ration protéiprive induit une augmentation du catabolisme protéique du muscle, ce qui induit une grande libération de glutamine, cette dernière sera métabolisée en proline. (de Lange et al., 1989a; Mariscal-Landin et De Souza, 2006). Néanmoins, Butts et al., (1993) et Leterme et al., (1996a) ont montré que les régimes protéiprives ne conduisent pas à une diminution des sécrétions endogènes basales de la plupart des AAs à l’exception de la proline. Hodgkinson et Mouhan (2000) et Zhang et al. (2005) n’ont observé aucune différence des pertes endogènes avec une ration contenant moins de 5 % de peptides/protéines. Une méthode améliorée par Moughan et al. (1990) consiste à alimenter les animaux avec une ration protéiprive enrichie en caséine hydrolysée de peptides de faibles poids moléculaires (inférieurs à 5000Da). Selon ces auteurs, si les AAs et les peptides de la caséine hydrolysée étaient totalement absorbés,

la quantité excrétée devrait correspondre à la seule perte endogène. En réalité, l’hydrolysat de caséine ne serait pas totalement digestible et l’azote non digéré se présenterait sous forme d’AAs libres ou d’oligopeptides dans les digesta. Ces auteurs proposent dans ce cas d’avoir recours au fractionnement des peptides. Par ailleurs, ils tiennent ces petites molécules pour négligeables dans les pertes endogènes même si elles représentent environ 10 % des molécules aminées (Moughan et Schuttert, 1991). D’après Leterme et al. (1994), ces molécules représentent au moins 20 % de l’azote total au niveau de l’iléon. Cette méthode évite donc les problèmes rencontrés avec la ration protéiprive en maintenant les pertes endogènes d’azote à un niveau physiologique normal, mais elle ne serait pas parfaitement quantitative.

La régression

La méthode de régression linéaire consiste à alimenter des animaux avec des rations contenant des concentrations en protéine progressivement croissantes avec une matière sèche ingérée constante afin de déterminer le flux endogène de protéine et d’AAs à une valeur de zéro protéine alimentaire par extrapolation. Cette approche permet une estimation du flux endogène de la protéine et des AAs dans des conditions plus physiologiques que celles obtenues avec une ration protéiprive (Fan et al., 1995b; Donkoh et al., 1999). Cette méthode est critiquable, car elle suppose une linéarité parfaite entre les pertes endogènes et les AAs ingérés. Ceci suppose d’une part, l’absence de tout processus d’adaptation digestive lié aux quantités d’aliments ingérés et d’autre part une proportionnalité parfaite entre les pertes endogènes spécifiques et les concentrations en constituants alimentaires stimulant les sécrétions digestives, ce qui serait inexact (Souffrant, 1991; Butts et al., 1993; Leterme et Théwis, 1995). De plus, cette technique est compliquée à mettre en place en routine puisqu’elle nécessite l’emploi d’au moins quatre aliments différents.

Estimation des pertes endogènes totales Dilution isotopique

Cette technique fait appel à un isotope stable (non radioactif) de l’azote (15_{N) ou du}

carbone (13_{C) (Arentson et Zimmerman, 1995). Cette méthode est précise, mais très}

lourde à mettre en œuvre. Elle permet de déterminer la DIR des AAs (Low, 1982). Le principe de cette méthode consiste à marquer l’animal ou l’aliment par la mesure de la dilution par la fraction non marquée dans les digesta. Ainsi les quantités d’azote d’origine endogène et alimentaire présentes dans les digesta sont calculées à partir de la connaissance de l’enrichissement initial en 15_{N des constituants marqués et de}

l’enrichissement mesuré dans les digesta. L’administration du traceur peut être réalisée par l’infusion intraveineuse continue (de Lange et al., 1992; Schulze et al., 1995a; Lien et al., 1997) ou par l’administration orale (Steendam et al., 2004b) jusqu’à l’atteinte d’un plateau considéré comme un état d’équilibre auquel les mesures de digestibilité doivent être effectuées. Les deux méthodes permettent d’obtenir le même flux endogène de protéine et d’AAs (Steendam et al., 2004b).

Marquage de l’animal

Le marquage de l’animal est obtenu par la perfusion prolongée (> 5 jours) d’un AA marqué en 15_{N. L’AA le plus souvent utilisé chez les animaux d’élevage}

(monogastriques et ruminants) est le 15_{N-L-Leucine (de Lange et al., 1990; Schulze et}

al., 1995a). Selon Leterme et al. (1997, cité par Jondreville, 1996), cela s’explique, d’une part par le prix de cet AA et d’autre part parce qu’il permet le transfert du N marqué à d’autres AAs (ileucine, valine, glycine et alanine) par transamination jusqu’à obtenir un état stable. La mesure de l’enrichissement de l’N permet de déterminer la quantité totale d’N endogène dans les digesta, mais il faut recourir au profil qualitatif obtenu avec la ration protéiprive pour disposer des valeurs pour chaque AA. De plus, la détermination du niveau de marquage des protéines endogènes présente certaines difficultés. Après plusieurs jours de perfusion, les protéines endogènes à renouvellement rapide sont marquées de la même façon que le pool d’AAs libres précurseurs de leur synthèse. Le pancréas prélève les AAs précurseurs pour la synthèse

enzymatique exclusivement dans le pool sanguin. Toutefois, la paroi intestinale prélèverait les matériaux de synthèse de ses sécrétions aussi bien dans le sang que dans la lumière intestinale et en proportions variables. Les cellules productrices de mucus, par exemple, s’approvisionneraient surtout dans le pool sanguin, tandis que les cellules du sommet des villosités intestinales marqueraient leur préférence pour les AAs alimentaires (Leterme et Théwis, 1995; Lien et al., 1994). Pour cette raison, les sécrétions endogènes ne représenteraient pas en moyenne le même enrichissement que le pool sanguin. Par ailleurs, la mesure de l’enrichissement en 15_{N du pool précurseur}

est effectuée dans la fraction déprotéinisée du sang soluble dans une solution d’acide trichloracétique. Or, Lien et al. (1994) ont montré, dans leurs conditions expérimentales, que les AAs libres ne représentaient qu’un tiers de l’N total de cette fraction. Le reste était constitué d’N non protéique avec un enrichissement 15_N

beaucoup plus faible que celui des AAs libres. Cela aboutirait donc à une nette surestimation des flux endogènes. La détermination du marquage de chaque AA permet de mesurer très exactement la quantité excrétée d’origine endogène. Toutefois, cela n’est pas possible pour les AAs strictement indispensables comme la lysine et la thréonine qui ne « transaminent » pas.

Marquage de l’aliment

Pour la mise en œuvre de la technique de marquage des aliments, la matière première à étudier est enrichie par l’application d’engrais marquée sur la culture (Partridge et al., 1983; Leterme et al, 1996c). En raison de sa complexité, cette méthode est moins utilisée que le marquage de l’animal (Leterme et al., 1996c; Hess et al., 1999). L’avantage de cette technique réside dans le fait que tous les AAs sont enrichis et qu’il est possible de déterminer le rapport endogène/alimentaire pour chacun d’eux, y compris la thréonine et la lysine. Leterme et al. (1996c) ont détecté, chez des porcs nourris avec un repas enrichi en 15_{N, une partie de} 15_{N dans le sang après à peine 10}

minutes, dans les enzymes pancréatiques en moins de 50 min, dans la sécrétion de bile en 90 min et dans les mucines iléales dans les 4 h suivant le repas. Cependant, en limitant la récolte du digesta à 8 h après le repas, il est susceptible de réduire le marquage total des pertes de protéines endogènes (Leterme et al., 1996c). Malgré un recyclage possible, les flux de protéines endogènes seraient plus élevés avec la

procédure de dilution isotopique qu’avec la méthode sans protéines (Hess et al., 2000). Néanmoins, les facteurs antinutritionnels et les fibres incluses dans les rations enrichies en 15_{N peuvent induire une confusion « marquage non spécifique» (Leterme et al.,}

1993).

Technique de marquage de l’aliment à l’homoarginine (Guanidination)

Cette méthode consiste à transformer les résidus lysine de la chaîne polypeptidique en homoarginine (Hagemeister et Erbersdobler, 1985) par la guanidination de la protéine alimentaire. L’AA basique (l’homoarginine) est absorbée de la même manière que la lysine à travers la paroi intestinale, mais il ne participe pas au métabolisme (Schmitz et al., 1991). La lysine endogène peut alors être distinguée de l’homoarginine alimentaire non digérée dans le digesta iléal, en supposant que l’homoarginine présente une digestion et une absorption équivalente à celles de la lysine (Schmitz et al., 1991). Cependant, les conséquences de l’absence de lysine dans la ration sur le métabolisme des sécrétions endogènes demeurent a déterminer. Par ailleurs, cette technique présente deux inconvénients majeurs. D’une part, le temps de mesure doit être limité, car les porcs refusent de consommer ce produit en raison de son très mauvais goût. D’autre part, cette technique ne semble pas adaptée aux protéines chauffées. Schmitz et al. (1991) constatent que seulement 64,8 à 80,5 % de la lysine de la caséine traitée à la chaleur est transformée en homoarginine, contre 89,6 à 99,6 % dans la caséine native. En effet, dans les caséines traitées à la chaleur, les chaînes secondaires de lysine sont bloquées par les réactions de Maillard ou de «cross linking» et ne peuvent pas être marquées. La lysine des digesta n’est donc pas exclusivement d’origine endogène. Les sections de protéines dénaturées par la chaleur ne pouvant être marquées sont supposées être moins dégradables, comparées aux segments à chaînes secondaires de lysine accessibles à la guanidation.

1.6. Facteurs de variation de la digestibilité iléale des acides aminés