Techniques d’amplification sur hémocultures positives

Parmi les techniques à base d'amplification la PCR est la plus couramment utilisée. Différentes approches sont disponibles pour effectuer la PCR sur des hémocultures positives:

 Essais pathogène-spécifiques : Leur applicabilité en tant qu’outil diagnostic est limitée en raison de l'énorme variété d'agents pathogènes potentiellement responsables de la BSI.

 Essais à large spectre : basés sur l'utilisation d'amorces qui reconnaissent des séquences conservées des gènes chromosomiques bactériens codant pour l'ADN ribosomal.

 Essais multiplexes : détectent les gènes des pathogènes les plus fréquemment impliqués dans la BSI en une seule réaction.

7.1.2.1. Essais à large spectre

* Prove-it Sepsis (tableau 12) : Les résultats dans ce test sont lus automatiquement par un instrument et l'interprétation est effectuée par un logiciel dédié (Prove-it Advisor, Mobidiag). En plus du large spectre des pathogènes détectés, le test est capable d'identifier la présence du gène mecA comme une aide à l’identification de la résistance à la méthicilline chez S. aureus et SCoN. La sensibilité et la spécificité sont 94% et 96%, respectivement, d’après l'entreprise.

* HyPlex BloodScreen (tableau 12) : ce test est également disponible en formats pour permettre la détection de marqueurs de résistance aux antibiotiques, tels que les gènes van et plusieurs gènes de la β-lactamase.

* Abbott / Ibis a récemment élaborée une nouvelle stratégie pour la détection moléculaire des infections systémiques par couplage de la PCR à large spectre à l'ionisation par electrospray / spectroscopie de masse (PCR / ESI-MS). Cette technique, PLEX-ID BAC Spectrum (tableau 12), utilise des amorces conçues pour cibler des régions génomiques hautement conservées chez les bactéries ou les champignons. Un aspect important de la technique, c'est que la méthode est quantitative en raison de la présence d'un calibrant interne qui agit comme un contrôle de la PCR.

7.1.2.2. Essais multiplex :

Plusieurs tests basés sur la PCR multiplex ont été développés dans ces dernières années, et les trois tests suivants sont conçus pour détecter un seul agent pathogène et ses propriétés génétiques, telles que la présence des gènes codant pour la résistance aux antibiotiques.

Le système StaphPlex (tableau 12) permet d’amplifier et détecter 18 gènes spécifiques à S. Aureus simultanément en une seule réaction et plusieurs autres déterminants d’antibiorésistance: le gène tuf permet l'identification et la différenciation des SCoN, le gène nuc est spécifique pour S. aureus. Les gènes suivants sont responsables de la résistance: mecA pour la méthicilline, aacA pour les aminoglycosides, ermA et ermC pour les macrolides, lincosamides et streptogramines, et tetM et tetK pour la tétracycline.

Plusieurs tests d’amplification pathogène-spécifiques sont disponibles pour différencier les SASM des SARM et, dans certains cas, les SCoN. Le premier de ces tests approuvé par la FDA aux Etats-Unis a été le StaphSR (tableau 12). Ce test est exécuté sur l'instrument SmartCycler amplifiant des séquences spécifiques de S. aureus et une cible spécifique à proximité du site d’insertion SCCmec (jonction orfX) chez le SARM. Il existe plusieurs publications sur la performance du test. Bien qu'une étude clinique réalisée sur 300 hémocultures ait rapporté d'excellentes performances (les sensibilités du SASM et du SARM sont de 98,9% et 100%, respectivement), d'autres ont noté la limitation de l'erreur d'identification des souches révertantes.

Il ya une seule publication sur le test sur hémoculture Xpert MRSA / SA (tableau 12). Les amorces et les sondes dans cet essai détectent les séquences du gène de la protéine A (spa), le SCCmec inséré sur le site d’insertion chromosomique de S. aureus attB, et le gène mecA. Dans cette étude, la sensibilité et spécificité de détection pour S. aureus était 100% et 98,6%, respectivement, et pour la détection du SARM ont été de 98,3% et 99,4%, respectivement. Ce test présente l'avantage du temps de réponse rapide (60 min) et l'accès direct, mais le prix par test et le capital initial frais sont prohibitifs pour de nombreux laboratoires. Bien que non encore approuvé par la FDA aux Etats-Unis, d'autres chercheurs ont mis au point des tests en temps réel sur l'instrument LightCycler (Roche, Mannheim, Allemagne) qui ciblent le gène mecA et le gène nuc.

D'autres techniques qui impliquent une étape d'amplification pour l'identification rapide des bactéries dans les hémocultures sont la LCRe, TMA et le test bDNA

Une liste des tests d'amplification qui peuvent être appliquées aux hémocultures positives est donnée dans le tableau 12.

Tableau 12 : Techniques d’amplification pour la détection des agents pathogènes en hémocultures positives [71].

Test Fabricant Principe Spectre de détection

Temps de réponse Prove-it Sepsis Mobidiag, Helsinki, Finlande PCR Multiplex combinée au microarray

C. perfringens, E. faecalis, E. faecium, L. monocytogenes, Propionibacterium acnes, S. aureus, S. epidermidis, SCoN, Streptococcus agalactiae, S. dysgalactiae ss. equisimilis, S. pneumoniae, S. pyogenes, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, E. cloacae, E. coli, H. influenzae, Kingella kingae, Klebsiella oxytoca, K. pneumoniae, N. meningitidis et non-meningitidis, Proteus mirabilis, P. vulgaris, P. aeruginosa, Salmonella enterica ss. enterica, Serratia marcescens, Stenotrophomonas

maltophilia, Bacteroides fragilis, C. jejuni/coli, Enterobacteriaceae 2,5 h Hyplex BloodScreen BAG, Lich, Germany

PCR multiplexe avec hybridation ultérieure sur plaque ELISA

SASM, SARM, S. epidermidis, S. pyogenes, S. pneumoniae, E. faecalis, et E. faecium, E. coli, E. aerogenes, P. aeruginosa, Klebsiella spp. 3 h PLEX-ID BAC Spectrum Abbott/Ibis, Abbott Park, IL, USA

Broad-range PCR à large spectre combinée avec l’ESI-MS

Théoriquement des centaines de pathogènes

8 h

StaphPlex Qiagen, CA, USA

PCR multiplex et caractérisation des amplicons par une gamme de suspension Luminex. S. aureus 5 h Staph SR BD GeneOhm, San Diego, CA, USA

PCR Multiplex en temps réel qui amplifie une séquence cible spécifique de S. aureus et une cible spécifique pour détecter la résistance à la méthicilline

S. aureus

Différencie le SASM du SARM

2,5-3 h Xpert MRSA/SA Cepheid Diagnostics, Sunnyvale, CA, USA

PCR en temps réel détectant une séquence du gène de la protéine A staphylococcique et détermine la résistance à la méthicilline

S. aureus

Différencie le SASM du SARM

1 h

ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; SARM, S. aureus résistant à la méthicilline; SASM, S. aureus sensible à la méthicilline ; ESI/MS : Electrospray Ionisation/Mass Spectrometry

En résumé, l'identification moléculaire des agents pathogènes après une première étape de croissance dans des milieux de culture de sang peut être atteinte plus facilement soit avec les techniques d'hybridation ou d'amplification. Bien que l’étape initiale de la culture est la plus nécessaire, la plupart de ces dosages raccourcissent sensiblement le temps de l'identification des agents pathogènes ou la détection des gènes spécifiques de la résistance.

Bien que l'identification moléculaire permette un diagnostic plus rapide des infections bactériennes les plus fréquemment trouvés par hémoculture, l'effet clinique de la réduction du temps de manipulation n'est pas encore apparent. À l'heure actuelle, l'application générale de la PCR multiplex ou de l'amplification à large spectre suivie par l’analyse des séquences de micro-organismes après croissance sur hémoculture, et les techniques moléculaires pour identifier un ou quelques agents pathogènes, ne donnent pas beaucoup de bénéfice clinique ou d’amélioration du rapport coût-efficacité par rapport aux techniques classiques d'identification, car ils sont chronophages et laborieux. Cependant, leur praticabilité devrait s'améliorer dans un proche avenir.